2015 Fiscal Year Research-status Report

発光タンパク質のクロモフォア構造に関する生物有機化学的研究

Research Project

Project/Area Number	15K07413
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	久世雅樹神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (40335013)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	フォラシン / クロモフォア / 生物発光 / 有機合成 / 核磁気共鳴装置 / 天然物化学 / 生物有機化学 / 発光タンパク
Outline of Annual Research Achievements	フォラシンのクロモフォア（発光を司る化学構造）は、活性部位のシステイン残基とデヒドロセレンテラジン（DCL：発光基質）とが結合して生成することを明らかにしてきたが、いまだ詳細な構造は不明である。そこで、酸素との結合が予想される炭素を13Cで同位体標識すれば、核磁気共鳴装置（NMR）による測定で、クロモフォアに関するより詳細な化学構造の情報が得られると考えた。この標識炭素はsp2混成軌道であるが、酸素と結合するとsp3混成軌道となるので、13C-NMRスペクトル上での区別が容易となるり、クロモフォア構造に関する詳細な情報が得られる。本年度は、この13C標識デヒドロセレンテラジン（DCL）の化学合成を目的とした。 DCLの化学合成には様々な手法があるが、申請者は安価なグリシンを出発原料としてDCLを合成する手法を開発している。そこで、市販されている13C標識グリシンを出発原料として13C標識DCLを化学合成することにした。まずは、非標識グリシンからオキサゾロン、そしてアズラクトンを調製する段階について詳細に条件検討した結果、、反応温度と反応時間を精密に調整することで、反応収率がほぼ定量的になるように最適化できた。その後、フェニルピルビン酸へと加水分解し、セレンテラミンと縮合してDCLを化学合成する段階についても可能な限り反応条件を最適化した。この一連の条件検討の結果、13C標識の効率を高める事に成功し、13C標識グリシンを出発原料として13C標識DCLを化学合成する手法が確立できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の計画通り、13C標識DCLを化学合成する手法を確立できたので、研究はおおむね順調に推進している。
Strategy for Future Research Activity	本年度確立した13C標識DCLの化学合成方法により、標識体を供給し、実際にタンパク溶液での測定を目指す。遺伝子発現させたフォラシンを大量に入手できる方法を確立する必要がある。また、生細胞中での発現には成功しているので、より明るく発光する非天然型DCL誘導体の開発も目指す。