2016 Fiscal Year Research-status Report
ミラクリン類似タンパク質を用いたミラクリン味覚修飾活性発現機構の解明
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15K07445
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| Research Institution | Nigata University of Phermacy and Applied Life Sciences |
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Principal Investigator |
井深 章子 新潟薬科大学, 応用生命科学部, 教授 (60301420)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 甘味タンパク質 / 味覚修飾活性 / ミラクリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミラクリンは、酸味を甘味に変換する活性（味覚修飾活性）を有するホモ二量体タンパク質である。遺伝子配列の報告以来、複数の研究グループによって研究が進められてきたが、組換えタンパク質の大量生産が困難であり分子レベルでの解析が進んでいない。そこで本研究では、ミラクリンとアミノ酸配列の相同性が高いミラクリン類似タンパク質(Miraculin-like proteins, MLPs)を研究対象とし、アミノ酸置換によってMLPに味覚修飾活性を付与することで、ミラクリンの味覚修飾メカニズムを解明することを目指している。
初年度には、MLPsの中でも特にミラクリンとのアミノ酸配列相同性が高いブドウ由来MLP(vvMLP)の大量発現系の構築、精製条件の確立を行い、vvMLPが単量体として存在することを確認した。それを受けて、2年目である本年度は、vvMLPのX線結晶構造解析、vvMLPへの部位特異的変異導入を行った。
X線結晶構造解析については、本年度前半にX線結晶構造解析に適した結晶が得られ、構造決定に成功した。ただし、ミラクリンの二量体に相当するような分子間のパッキングは見られなかった。
一方、vvMLPとミラクリンの変異型タンパク質については、vvMLPとミラクリンのキメラ作成に先立ち、vvMLPへの部位特異的変異の導入を行った。具体的にはミラクリンにおいてサブユニット間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基をvvMLPに導入したが、この変異導入によってvvMLPの不溶化が起き、味覚修飾活性等の解析は行うことができなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、vvMLPのX線結晶構造解析、vvMLPへの部位特異的変異導入を行った。
X線結晶構造解析については、本年度前半にX線結晶構造解析に適した結晶が得られ、構造決定に成功した。vvMLPは単量体として存在することが昨年度の結果から明らかになっているが、結晶中においてvvMLPがミラクリン二量体に相当するような分子のパッキングをしていることを期待していた。しかし、残念ながらそのようなパッキングは見られず、ミラクリンの二量体構造についての情報は得られなかった。しかし、全体としては計画以上に研究が進展したものと考えている。
一方、vvMLPとミラクリンの変異型タンパク質については、課題が明らかになった。vvMLPとミラクリンのキメラ作成に先立ち、vvMLPへの部位特異的変異の導入を行った。具体的にはミラクリンにおいてサブユニット間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基をvvMLPに導入したが、この変異導入によってvvMLPの不溶化が起き、味覚修飾活性等の解析は行うことができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度はミラクリンの二量体間で共有結合を形成するシステイン残基をvvMLPに導入することを試みたが、タンパク質の不溶化が起こり、困難であることが判明した。
そこで今後は、このシステイン残基にこだわらず、全領域についてミラクリンとvvMLPのキメラを作成し、vvMLPをベースとしてどこまでミラクリンに近いタンパク質が調製できるかを試みる。
また、システイン残基導入によって不溶化した変異型vvMLPについても、大腸菌株の変更、シャペロンの共発現などを行い、可溶化する発現条件の探索を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
初年度からの未使用額に加え、設備備品として本年度購入を予定していた液体クロマトグラフィーシステムのバルブ部品を他の安価な部品に変更したことから、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰り越した予算は、消耗品（特にキメラ作成のための遺伝子関連試薬）の購入に充てる予定である。
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