2016 Fiscal Year Research-status Report
LC-MS/MS分析による大豆サポニンの化学構造推定
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15K07451
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
塚本 知玄 岩手大学, 農学部, 准教授 (20312514)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 大豆 / サポニン / 化学構造解析 / 遺伝解析 / プロファイル解析 / LC-PDA/MS/MS / NMR / 大豆加工食品 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大豆種子に含まれるサポニンは多様な分子種の総称であり，化学構造の違いにより健康機能性や呈味性が大きく異なると報告されているが，不明な点が多く再評価が求められている。一方，大豆種子サポニン組成は，各種酵素の発現を制御する多様な遺伝因子の共優勢，優勢，劣勢遺伝の組み合わせで決定される。そこで本研究は，微量，不安定，単離精製が困難などの理由で構造解析できなかった各種サポニンの化学構造を，遺伝解析とTLC並びにLC-PDA/MS/MS分析に基づく総合判断で推定する新しい手法「プロファイル解析」の確立を目指す。
(1) 化学構造が異なる種々の既知サポニンを含む大豆種子アルコール抽出液を薄層クロマトグラフィー（TLC）並びにLC-PDA/MS/MS分析し，得られた機器分析データ（TLCバンドの色と溶出位置，LC溶出位置，UVスペクトル，MSとMS/MSフラグメントパターン）とアグリコン骨格並びに糖鎖配列との相関関係をデータベース化した。
(2) サポニン組成変異体で観察される新規サポニンを単離精製し，精密質量分析，赤外吸収スペクトル分析，核磁気共鳴スペクトル分析（1H-NMR,13C-NMR,DEPT,HMBC, HMQC等）等で解析した結果，これらの化学構造は全て，プロファイル解析で推定した結果と完全に一致した。
(3) 化学変異原Ethylmethan-sulfonate（EMS）処理で得られた大豆系統群からサポニン組成変異系統をTLCで一次スクリーニングした結果，多様な変異が発見された。変異体に含まれる未確認サポニンの化学構造はプロファイル解析で予測できるため，変異遺伝子の機能解析（推定）が容易となった。
(4) 今回得られた大豆サポニンに関するプロファイル解析のデータベースは，オレアナン型である大豆サポニン以外にも，各種トリテルペン型サポニンの化学構造解析に広く応用できる可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成27年度並びに平成28年度計画では，以下の5項目を実施し，予定通りの結果が得られている。
(1) 未知サポニンの化学構造とMS/MSフラグメントパターンに関するデータベースの構築，(2) 未確認サポニン生合成に関与する遺伝因子の遺伝解析，(3) 未確認サポニンアグルコン（ソヤサポゲノールH，I）の単離精製と化学構造解析，(4) 未確認サポニン（ソヤサポゲノールJ配糖体）の単離精製と構造解析，(5) プロファイル解析手法を用いた大豆サポニン分析に関する妥当性の検討と評価
加えて，EMS処理大豆系統を用いて，新規なサポニン組成表現型を示す変異系統をスクリーニングした結果，これまで自然界では見られなかった種々の変異系統が見つかった。これらの変異系統で観察される未確認サポニンの化学構造解析をプロファイル解析により推定した結果，大豆サポニン生合成に関与する酵素群は，それらの有無が遺伝的に制御されているだけではなく，基質となるサポニン前駆体をめぐって，これまで考えていた以上に複雑で巧妙な酵素反応を進めるものと考えられた。
このように，極微量成分の化学構造を明らかにできる「プロファイル解析手法」は，生化学分野にも応用できると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
プロファイル解析手法を用いた大豆種子並びに大豆加工食品のサポニン組成の再評価を進める。
これまで，大豆不快味サポニン成分（グループAアセチルサポニン類）は大豆種子胚軸にのみ局在すると報告されてきた。しかし，物理的に胚軸を除去して子葉だけを原料として製造した豆乳でも，渋味などの不快味が感じられる。種子子葉には，部分的にアセチル基が取れた種々のグループA脱アセチルサポニン類が存在すると推定される。また，どのような未確認サポニンが，どのような濃度・含量で種子子葉に含まれるのかなどについても，これまでに得られたプロファイル解析手法の多くの情報を活用して，食品化学的立場から，各種大豆加工食品中のサポニン組成を再検討する。
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[Journal Article] Metabolic switching of astringent and beneficial triterpenoid saponins in soybean is achieved by a loss-of-function mutation in Cytochrome P450 72A692017
Author(s)
Yano, Ryoichi; Takagi, Kyoko; Takada, Yoshitake; Mukaiyama, Kyosuke; Tsukamoto, Chigen; Sayama, Takashi; Kaga, Akito; Sawai, Satoru; Ohyama, Kiyoshi; Saito, Kazuki; Ishimoto, Masao
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Journal Title
The Plant Journal
Volume: 89
Pages: 527-539
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Identification of mutants in the soyasaponin biosynthetic pathway using a high-density soybean mutant library: an indispensable resource for functional genomics2017
Author(s)
Krishnamurthy Panneerselvam, Yukiko Fujisawa, Hanako Abe, Urara Ohashi, Kentaro Yamane, Kyosuke Mukaiyama, Chigen Tsukamoto, Akito Kaga, Toyoaki Anai, and Masao Ishimoto
Organizer
Plant & Animal Genome XXV
Place of Presentation
San Diego, California, USA
Year and Date
2017-01-14 – 2017-01-18
Int'l Joint Research
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