培養細胞固定化センサチップを用いたSPRセンサによる細胞毒性評価法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07457
• Research Institution: Fukuoka Women's University
• Principal Investigator: 小林 弘司 福岡女子大学, 国際文理学部, 准教授 (00610255)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石川 洋哉 福岡女子大学, 国際文理学部, 准教授 (00325490)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: SPR / 毒性評価 / 細胞培養 / ベロ毒素

Outline of Annual Research Achievements

従来の培養細胞を用いた毒性評価は, 細胞の形態変化や死滅を観察する必要があり, 結果が得られるまでに数日を要する. 本研究は, 培養細胞と物質の相互作用をSPRセンサにより測定し, 簡易迅速な毒性スクリーニングに応用することを目的としている. 本年度は, ベロ細胞のベロ毒素による応答をSPR測定するための条件について検討を行った.
まず、センサチップ上への細胞固定化法の最適条件を検討した。センサチップ上に細胞を固定化するための培養時に血清成分が金膜に付着することが考えられたたため、10％FBS添加DMEM培地と無血清培地であるKBM230培地とでのセンサチップ上への細胞の付着を比較した。その結果、血清を添加した培地で培養した方がセンサチップ上への細胞固定化が高効率であることを確認した。また、10％FBS添加DMEM培地のみを同様に培養してもSPRシグナルは上昇しなかったことから、血清成分がセンサチップ上へ付着しないことも確認した。また、SPR測定時には培地を取り除き, PBSに置換することで安定したシグナルを観察することができた.
最後に、ベロ細胞とベロ毒素の応答によるSPRシグナル変化の測定を試みた。その結果、SPRシグナルは添加したベロ毒素の濃度依存的に上昇した。また、熱変性させたベロ毒素を添加してもシグナルは上昇しなかった。さらに、ベロ毒素添加後の細胞の状態を1時間ごとに顕微鏡観察した結果、細胞の障害が確認できたのは3時間後だったのに対して、SPR測定では1時間後から有為なシグナルの上昇を確認することができた。以上の結果から、ベロ細胞のベロ毒素への応答がSPRにより迅速に測定可能であることが示され、細胞毒性評価方としてのSPRセンサの可能性が示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画時には、SPRセンサユニットをCO2インキュベーター内に組み込まなければ測定できないことが危惧されたが、培養した細胞を一時的にインキュベーターから取り出しても測定できることが確認できたため、順調に研究は進捗している。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、一般的に毒性表に用いられているV79細胞またはL929細胞を固定化したセンサチップを用いたコロニー形成試験および増殖抑制試験による毒性評価試験を予定している．毒性試験対象物質としては，マウスLD50が明らかとなっている食品添加物 (亜硝酸ナトリウム，ソルビン酸カリウム，アスコルビン酸および安息香酸トリウム) および毒性が詳細に検討されておらず，むしろ抗酸化成分など有用な成分が注目されている天然抽出物 (ウコン抽出物，しょうが抽出物など) を多量に摂取した際の細胞の影響を検討する．このため，天然抽出物のin vitro での抗酸化作用の確認，培養細胞を用いた抗酸化作用の確認を行う．

Causes of Carryover

CO2インキュベーターにSPR装置を組み込む必要がないことが判明したため、試作品作製費が不要になった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成29年度は、これまでに確立した手法を用いて様々な細胞と物質との相互作用を測定予定であるため、多量のセンサチップが必要になる。このためのセンサチップ購入費に充てる予定である。