2015 Fiscal Year Research-status Report
糖光学分割のための新規キラル場の構築とL-糖の探索
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15K07458
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
小玉 修嗣 東海大学, 理学部, 教授 (70360807)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
多賀 淳 近畿大学, 薬学部, 准教授 (20247951)
會澤 宣一 富山大学, 理工学研究部, 教授 (60231099)
山本 敦 中部大学, 応用生物学部, 教授 (60360806)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 単糖 / 光学異性体 / 逆相HPLC / 誘導体化 / ジアステレオマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
L-アミノ酸などの光学活性物質を用いてD-およびL-体の単糖類を誘導体化させてジアステレオマーとし、その誘導体を逆相HPLC法により一斉分析法の確立を目的とする。
(1) L-アミノ酸を用いた単糖の誘導体化法及びHPLC分析条件の検討： これまでの研究で、ガラクトース、グルコース及びマンノースをL-トリプトファンで還元アミノ化し、逆相HPLC法で各光学異性体分離だけではなく、各エピマー間の分析法を検討してきた。しかし、この分析法では、各ピークの分離が十分でないこと、ピーク検出後の19分～21分にかけて未反応のL-トリプトファンの大きなピークがあり、“分析window”が狭いことが課題となっている。しかし、各ピークの分離が十分でないこと、ピーク検出後に未反応のL-トリプトファンの大きなピークがあり、“分析window”が狭いことが課題となっている。
そこで、種々のL-アミノ酸類を用いて検討したところ、L-トリプトファンアミドで誘導体化する方法が最もよいことを見いだした。その理由として、誘導体化後の酢酸エチルによる溶媒抽出により、未反応のL-トリプトファンアミドを大幅に除去できること、及びHPLC法の移動相をこれまでの塩基性から中性に変えることにより、先に微量残留している未反応のトリプトファンアミドが先に溶出し、その後誘導体化単糖が溶出するため、分析windowを拡大することが可能になったことが挙げられる。この方法により、3種の六単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース）に加えて3種の五単糖（リボース、アラビノース、キシロース）を同時に光学異性体分離することが可能となった。
(2) 試料前処理法の検討： 現在、新規な前処理用のカートリッジ充填剤に加えて、前処理用の分離カラム充填剤の検討を行っている。特に、塩基性条件下での利用を考えているため、充填剤の安定性の向上を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の最大の目的はより多くの単糖類を一斉に光学異性体分析できる方法を確立することである。
(1) 単糖類光学異性体分析法の開発： これまでの研究では各単糖の光学異性体をL-トリプトファンで誘導体化することによりジアステレオマーとし、逆相HPLC法で単糖類の光学異性体を分析可能であることが分かっていた。しかし、この方法では分析windowが狭いため、より多くの単糖類に適用することは困難であった。本年度は種々のL-アミノ酸類を用いた誘導体化法を検討した。単糖類にはUV吸収が乏しいこともあり、UV吸収を持つアミノ酸類で検討した結果、L-トリプトファンアミドが最適であることが分かった。さらに、未反応のL-トリプトファンアミドは酢酸エチルでの溶媒抽出による除去が可能であること、さらに中性と塩基性の移動相では、未反応のL-トリプトファンアミドと誘導体化単糖類の溶出順が逆転することを見いだした。このため、中性移動相を用いることにより、6種類の単糖類の光学異性体計12種類のエピマーを分離検出することが可能となった。
(2) 分離挙動の解明： 単糖類の光学異性体、D-及びL-体はアルデヒド基から最も遠い不斉炭素原子に結合する水酸基の向きによって決められている。一方、上記のHPLC法での分離挙動ではD-体が先に溶出する単糖とL-体が先に溶出する単糖が観察された。単糖の分子構造から、アルデヒド基に最も近い不斉炭素原子に結合した水酸基の向きが溶出順を決めていることが分かった。すなわち、単糖光学異性体の溶出順はD-体、L-体とは関係なく、C2炭素原子がR-配置の単糖光学異性体は速く、S-配置のものは遅れて溶出することが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題の目的は単糖類の光学異性体を一斉分析できるHPLC法を開発し、植物や食品中にL-体の単糖類が存在するか否かを明らかにすることである。
昨年度は6種類の単糖類について各光学異性体を一斉に分析できる方法を開発できた。この研究成果を基に以下の項目について今後検討する。
(1) 現在のHPLC分析法をさらに発展させて、3種類の六単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース）と3種類の五単糖（キシロース、リボース、アラビノース）以外の単糖類についても一斉に光学異性体分析できるような分析方法の改良を検討する。また、ジアステレオマー形成時にラセミ化が起こっていないことの確認試験、分析方法の再現性や直線性などの定量にかかわる検討を行う。
(2) 単糖類は種類が多く、やみくもに分析することは困難である。L-ガラクトースは植物の葉におけるアスコルビン酸合成経路の中間体であることが報告されているが、その中間体であるL-ガラクトースを未だ検出したという報告はない。このため、ガラクトースをL-糖探索の第一のターゲットとする。ガラクトースは主要成分ではないため、植物から単糖類を抽出した後、いかに妨害物質を除去してガラクトースを精製できるかが課題となる。このため、溶媒抽出法、既存の前処理カートリッジや糖分析カラムなどの固相抽出法を用いた単糖の精製法を検討する。さらに、昨年度に引き続き、糖分析用の樹脂の開発を行い、それを充填したカラムやカートリッジによる前処理法を検討する。
(3) 昨年度に引き続き、L-トリプトファンアミド誘導体化単糖光学異性体について、質量分析法、円二色性スペクトロメトリー及び光学活性シフト試薬を用いたNMR分析による同定法を検討する。
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Research Products
(2 results)
