2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K07504
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
金野 尚武 宇都宮大学, 農学部, 准教授 (60549880)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | きのこ / 生体材料 / 応用微生物 / 糖 / バイオマス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
きのこ類に含まれるβ-1,6グルカンは免疫活性化機能を持つ。しかしながら、きのこ類からの単離・精製は困難であるため、純粋なβ-1,6グルカンが得られた例はない。そこで本研究では純粋なβ-1,6グルカンを人工合成することを目的とした。平成27年度は、β-1,6グルカン分解酵素（グルカナーゼ）の合成酵素への変換を行った。スエヒロタケ（Schizophyllum commune）およびウシグソヒトヨタケ（Coprinopsis cinerea）由来のβ-1,6-グルカナーゼ（Sc30、Cc30）を本検討に用いた。類似酵素群とのマルチアライメントから、完全に保存されている２つのグルタミン酸、225番目と320番目（Sc30）、207番目と302番目（Cc30）のグルタミン酸が、それぞれ活性中心残基であると予想された。これらグルタミン酸をグリシンに置換したSc30Mu1（E225G）、Sc30Mu2（E320G）、Cc30Mu1（E207G）、Cc30Mu2（E302G）の４種のリコンビナントタンパク質をこうじ菌を用いて異種発現させ精製した。得られた酵素にはβ-1,6-グルカン分解活性が検出されなかったことから、これらグルタミン酸が活性中心残基であることが明らかになった。得られた酵素をそれぞれ100ｍM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）、20ｍMフッ化ゲンチオビオース、20℃、48ｈの条件で反応させた。生成物を検出したところ、Sc30Mu2、Cc30Mu2において、２糖以上のオリゴ糖と多糖が検出でき、β-1,6-グルカンの合成に成功したと考えられた。現在、得られた生成物の構造解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
年次計画において、H27年度はβ-1,6グルカン合成酵素の獲得が課題であった。きのこ類（スエヒロタケおよびウシグソヒトヨタケ）由来のβ-1,6グルカナーゼを合成酵素への変換することに成功し、フッ化ゲンチオビオースを用いて糖転移活性を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
きのこ類β-1,6-グルカナーゼの活性中心であるグルタミン酸をグリシンに置換したリコンビナントタンパク質を調製し、合成酵素へ変換できたが、β-1,6グルカン生成物の収率が当初の予定よりも低いことから、活性中心のアミノ酸をアラニン、セリンに置換した酵素を作製し、合成能を比較する。
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| Causes of Carryover |
β-1,6グルカン合成に必要な消耗品の購入を来年度に持ち越したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
β-1,6グルカンおよび酵素分析用の消耗品、培地成分、オリゴ糖標品、電気泳動用試薬、タンパク精製用樹脂などを購入する。
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[Journal Article] Identification and enzymatic characterization of an endo-1,3-β-glucanase from Euglena gracilis2015
Author(s)
Takeda T., Nakano Y., Takahashi M., Konno N., Sakamoto Y., Arashida R., Marukawa Y., Yoshida E., Ishikawa T., and Suzuki K.
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Journal Title
Phytochemistry
Volume: 116
Pages: 21–27
DOI
Peer Reviewed
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