2015 Fiscal Year Research-status Report
エビ類の疾病予防への新たなアプローチ‐免疫系と内分泌系のクロストークの解明‐
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15K07555
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
伊丹 利明 宮崎大学, 農学部, 教授 (00363573)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
酒井 正博 宮崎大学, 農学部, 教授 (20178536)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | クルマエビ / サイトカイン / インスリン様ホルモン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、エビ類において細胞増殖や細胞・組織の活性化等を制御するサイトカインとホルモンとのクロストークに着目し、疾病防除を目的として、従来の免疫機構の解明に加えて、性成熟や脱皮などエビ類特有の内分泌機構から見た新たなトランスレーショナルリサーチを目指す。エビ類養殖は世界の熱帯地域の発展途上国で、主要な1次生産品となっているにもかかわらず、疾病の多発によって生産量の実質的な減少局面をむかえている。そこで、本研究では本研究室で明らかにしたサイトカイン遺伝子とエビの内分泌遺伝子との相互作用を明らかにして、新たな疾病対策の基盤を構築するものである。
初年度には、Thyrostimulinおよびインスリン様活性を持つホルモンであるインスリン様成長因子群(insulin-like growth factors; IGFs) について検討した。Thyrostimulin分子は2種類の糖タンパク質 (glycoprotein hormone subunit alpha 2; GPA2と、glycoprotein hormone subunit beta 5; GPB5) がヘテロ2量体を構成している。これらの遺伝子の全長解析をほぼ終了した。確認のための再検討を行っている。発現解析を行ったところ、若干ではあるがこれらの遺伝子発現には脱皮との関連が強いことを示唆する結果が得られた。そこで、経験的に脱皮促進の効果があるとされるストレス負荷（低酸素）状態における遺伝子発現を調査したところ、Hypoxia Inducible Factor-1、-2遺伝子(HIF-1, -2)、Glucose Transporter遺伝子(GLUT)、および血管新生に関与するVascular Endothelial Growth Factor遺伝子(VEGF)の4つの遺伝子の発現が上昇した。ことから、これらの遺伝子を指標とすることによって、脱皮させる条件が明らかとなる。さらに、節足動物においてＩ型インターフェロン様遺伝子として知られているVago遺伝子を検出し、発現解析ができたので、今後の内分泌系遺伝子とのクロストークを解明するための重要な遺伝子として活用できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた実験項目はほぼ網羅している。glycoprotein hormone subunit alpha 2; GPA2と、glycoprotein hormone subunit beta 5; GPB5のdRNAによるノックダウンについては現在試験中であり、死亡個体が見られるなど当初予測していた結論と一致している。これらに加えて、ストレス負荷によって発現する各種遺伝子（Hypoxia Inducible Factor-1 (HIF-1、-2) 遺伝子、Glucose Transporter (GLUT) 遺伝子、Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) 遺伝子、Ｉ型インターフェロン様遺伝子：Vago遺伝子、p38遺伝子、JNK遺伝子、p53遺伝子）の発現動態が明らかになったことから、予定以上の成果があった。とくにサイトカイン系の遺伝子はその多機能性から多くの遺伝子とのネットワークが構築されていると考えられる。このような観点から、内分泌系遺伝子の動態を調べるためには上述したサイトカインやシグナルトランスダクションの関連する多くの遺伝子情報が必要であり、その整備が整ってきていると言える。
今回の遺伝子情報を基盤にして、今後の本研究推進に当たって、より多くの遺伝子による周辺情報も得られる。このことから、本研究の目的であるサイトカイン系遺伝子とエビの内分泌系遺伝子との相互作用をより広い範囲で網羅的に研究することが可能となった。今後の研究の基盤的情報が集積されつつある。
以上の理由から、進捗状況としてはほぼ適正に研究が進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
glycoprotein hormone subunit alpha 2; GPA2と、glycoprotein hormone subunit beta 5; GPB5のdRNAによるノックダウンについては現在試験中であり、より確実な結果を確認する。バキュロウイルスOpMNPV由来のプロモーターOpIE2および精製用にHisタグを有するベクターへGPA2、GPB5またはIGF遺伝子群のORF領域の塩基配列を組み込み、昆虫細胞Sf9へ遺伝子導入する。培養後、細胞培養液の上清からウエスタンブロット法により目的タンパク質の発現を確認する。タンパク質の発現については、大腸菌の系についても合わせて検討する。次に、Hisタグ精製を行い、リコンビナントタンパク質 (rGPA2、rGPB5またはrIGFs) を定量する。新規ホルモンの生理活性の検索については、Boydenチャンバー法を用いてクルマエビの血球の走化性を観察する。また、造血幹細胞（エビの胃上部にある造血組織から分離・培養に成功）および器官培養したリンパ様器官を各リコンビナントタンパク質で感作し、細胞の増殖や分化について検討する。細胞の増殖については、ブロモデオキシウリジン (BrdU) の取りこみを計数する。細胞分化については、形態観察を行う。その他の生理活性については、血球の貪食活性とリゾチーム活性を検討する。血球に各リコンビナントタンパク質を感作後、i) 炎症反応において重要なNF-κB経路にある遺伝子群 (MyD88, TRAF6, IKK, NF-κB)、ii) 細胞増殖・分化やアポトーシス等で重要なMAPキナーゼ関連遺伝子群 (ASK1, JNK, p38, p53)、iii) 病原体感染時において重要なJAK/STAT経路に位置する遺伝子群 (Domeless, JAK, STAT, SOCS, PIAS)の発現動態を調べ、シグナルトランスダクションを解明する。なお、上記の遺伝子は全て本研究室において同定済みである。
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[Journal Article] Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against White spot syndrome virus in Freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous.2016
Author(s)
Rajashekar Reddy, C.B., Dinesh, S., Anusha, N., Itami, T., Rajasekhara Reddy, S., Sudhakaran,
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Journal Title
Aquaculture Research
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Adjuvant effects of poly I: C and imiquimod on the immunization of kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus) with a recombinant protein, VP28 against white spot syndrome virus.2015
Author(s)
Kono, T., Biswas, G., Fall, J., Itami, T., Sakai, M.
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Journal Title
Aquaculture
Volume: 446
Pages: 236-241
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Development of simple, rapid and sensitive detection assay for grouper nervous necrosis virus using real-time loop-mediated isothermal amplification.2015
Author(s)
Mekata, T., Satoh, J., Inada, M., Itami, T., Sudhakaran, R.
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Journal Title
Journal of Fish Diseases
Volume: 38
Pages: 873-879
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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