2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K07687
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
堀居 拓郎 群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (00361387)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
畑田 出穂 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (50212147)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 半数体 / ES細胞 / CRISPR/Cas |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞分裂異常によりゲノムが4倍体になると p53 依存的なチェックポイントがはたらき、細胞分裂の停止(p21 活性化)および細胞死(Bax 活性化)へと導く(Andreassen et al., Mol Biol Cell, 2001; Fujiwara et al., Nature, 2005)。我々は、ゲノムが半分量になっても、p53 依存的チェックポイント がはたらき、2倍体化した細胞の増殖が有利となると予想している。また栄養膜幹細胞である TS 細胞などが多核化する場合、p57、p21 の活性化により細胞質分裂が阻害されてゲノムが倍化する (Ullah et al., Gene Dev, 2008)。特に p57 については、インプリントを受けており、母方由来の DNA からのみ発現する。すなわち、未受精卵由来の半数体 ES 細胞では p57 が過剰に発現している可 能性がある。以上のことをふまえ、これらの因子を KO もしくは阻害することにより継代中の半 数体細胞の比率がどのように変化するのか調べた。
平成２８年度は、p53 KO半数体 ES 細胞の樹立を行なった。p53+/-マウスを過排卵処理して未受精卵 を回収した。未受精卵は塩化ストロンチウム活性化培地で培養することで単為発生させ、桑実期胚を ES 細胞樹立培地で培養することにより、半数体 ES 細胞の樹立を行なった。現在、倍数性の確認等を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２８～２９年度にかけて、複数の遺伝子をKOした半数体ES細胞の樹立を予定している。平成２８年度はp53-KO 半数体ES細胞の樹立を行うことができたので、おおむね順調に遂行できていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
KO 細胞株を用いて、FACS で倍数性の確認を行う。 KO 細胞株では野生型と 比べ、半数体の比率が多いと予想している。また、RNA およびタンパクを抽出して、それぞれ real-time RT-PCR およびウエスタンブロットによって、mRNA 発現量や活性化タンパクの量を測定し、野生型細胞株と比較する。また、半数体のチェックポイントが存在するならば、G1 期で の細胞周期の停止およびアポトーシスが起きているかもしれない。そのため、G1 期の細胞の割 合および TUNEL 染色によるアポトーシス細胞の割合を FACS(FACSVerse, BD 社)で解析する。 さらに、これらの因子は染色体の安定性にも関わるので、染色体数が半数体(1N=20)を正確に 維持しているのか染色体標本を作製して確認する。
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Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Targeted DNA demethylation in vivo using dCas9-peptide repeat and scFv-TET1 catalytic domain fusions.2016
Author(s)
Morita S, Noguchi H, Horii T, Nakabayashi K, Kimura M, Okamura K, Sakai A, Nakashima H, Hata K, Nakashima K, Hatada I.
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Journal Title
Nature Biotechnology
Volume: 34
Pages: 1060-1065
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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