季節繁殖動物における精原幹細胞ニッチシステムの解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07688
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 恒川 直樹 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (50431838)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 九郎丸 正道 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00148636)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 精原幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

精子の幹細胞である精原細胞には未分化型と分化型が存在し、このうち未分化型を精原幹細胞もしくは配偶子幹細胞と呼び、精細管内のニッチと呼ばれる微小環境に存在する。その分裂はセルトリ細胞により構成されたニッチシステムにより制御され、マウスを材料にして動態が少しずつ明らかになってきた。周年繁殖のマウスは、常に精子発生の活性が高く、このためニッチシステムが機能的に簡略化されている可能性があることから、本質的な制御機構を明らかにするためには、生殖細胞の数を激しく変動させる季節繁殖動物を精査する必要がある。本研究では、季節繁殖動物であるハムスターを用い、これまで着手することができなかった点の解決を試みている。非繁殖期に誘導により分化した精細胞は、精上皮から排斥され、GFRα１陽性の精原幹細胞を高頻度に探し当てることができ、さらに非繁殖期から繁殖期を材料にすることにより、GDNF発現とGFRα１陽性細胞の関連性を明確にした他、個体発生から生後発育過程におけるニッチシステムの成立過程にて組織学的に解析を行った。平成27年度は、精原幹細胞のニッチシステムの普遍性を調べるため、季節繁殖動物のハムスターを材料にして、セルトリ細胞からのGDNF分泌と精原幹細胞の動態との関連性を明らかにし、マウスとの詳細な比較を中心に行った。さらに平成28年度は、膨大な組織画像の解析すると共に、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマを材料にして、組織学的な比較検討を行った。その結果、マウスでは観察することのできないニッチシステムについて、比較形態学的な見地から新たな概念を提唱すことが可能になってきた。ニッチシステムは、種の連綿を支える精子の供給の根幹である。本研究を通じて得られる成果は、精原幹細胞ニッチシステムについて、その普遍性と、動物種による特殊性を示す事が可能になる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究代表者は、平成27年4月に研究機関の異動が生じたため、動物実験の大幅な遅延が生じているが、研究分担者との連携により、また過去の研究で採材された標本を利用することにより回避することができている。１）精細管におけるGDNF陽性/陰性領域の割合、２）それらの領域に存在するGFRα１陽性細胞の割合、３）シグナル活性化の度合い、４）GFRα１陽性の細胞質突起の数値（細胞の長軸/短軸の比率、突起の長さ）を形態計測により定量化を行い、形態学的な解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

非繁殖期から繁殖期の変化を調べるため、SSCsが集積するニッチを精細管レベルで単離し、アガロースゲルによる器官培養により組織培養を試る。さらに低温培養に切り替え、冬眠期を想定した環境で試み、SSCsの挙動を経時的に追跡し、生体環境との比較を行う。
比較形態学解析として、イヌ、ヤギ、スナネズミ、さらには一部の鳥類での抗体の交差性を確認する作業に力点を置く。状況によってはin situ Hybridizationによって、精巣内のニッチ領域の特定をすすめる。さらに、季節繁殖を示す動物として、アカネズミ、ヒミズ、スンクス、ホンドタヌキ、シカ、クマなど、研究材料が入手でき次第、組織学的な解析を行う。

Causes of Carryover

申請者は平成27年4月に所属の異動が生じたため、培養実験や動物実験について、一部において計画通りに展開することができなかった。代替手段として、過去に採材した試料を中心に組織学的な解析に力点をおき、研究をすすめた。このため、培養用の研究試薬や動物の購入および維持管理に必要な経費を執行することがなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

培養実験環境ならびに動物飼育環境について、利用可能になった。このため、平成29年度は培養実験と、その組織学的解析に必要な「薬品」、また培養等に必要な「プラスチック器具」を計上する。さらに「実験用動物」として、シリアンハムスターを入手するための経費とするとともに「実験動物用飼料・床敷」の購入費として経費を執行する予定である。

Research Products

• [Journal Article] In vivo dynamics of GFRalpha1-positive spermatogonia stimulated by GDNF signals using a bead transplantation assay (2016)
  • Author(s): Uchida, A. Kishi, K. Aiyama, Y. Miura, K. Takase, H. M. Suzuki, H. Kanai-Azuma, M. Iwamori, T. Kurohmaru, M. Tsunekawa, N. Kanai, Y.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 476 Pages: 546-552
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.05.160
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant