2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K07690
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
濱野 光市 信州大学, 学術研究院農学系, 教授 (70303443)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | ウシ精子 / 走温性 / 温度勾配 / 制御因子 / 発現機構 / 運動解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は走温性の未解明な基礎的研究を完成し、走温性を利用した精子の新しい診断方法や評価法を畜産現場に応用・展開するための基礎となる研究を行う。平成28年度は以下のことを明らかにした。
１．走温性発現因子の探索： 走温性発現精子のカルシウムイオン、カルシウム結合タンパクの関与を調べ、カルシウム欠培地内での負の走温性を確認するとともに、カルシウム結合タンパクである、カラクシン、カルモジュリンの阻害が走温性に影響し、移動精子が減少することを明らかにした。 ２．走温性発現機構の解析：継続して、走温性発現精子の移動性、方向の変化を調べ、速度、直線性、尾部屈曲の変化を確認した。 ３．走温性発現精子の細胞内カルシウム動態の解析：走温性発現精子のカルシウムの変化、動態を解析した。温度勾配、時間経過によるカルシウム濃度の変化を調べ、高温度域における精子のカルシウム濃度の増大を確認した。 ４．走温性発現精子におけるカルシウム作用機構の解明：カルシウム作用に関与する電位依存性チャネル、TRPCチャネル、細胞内放出チャネル、Cation channel of sperm (CatSper) 関連チャネルのそれぞれの阻害剤である、ベラパミル、SKF、ライアノジン、ミベフラジルを添加し、それぞれの阻害作用に応じて精子の移動、方向を変化する走温性を調べ、TRPCチャネル、細胞内放出チャネルの関与を確認した。 ５．走温性発現精子の受精機能の解析：受精能獲得前後における走温性と走化性の発現を調べ、受精能獲得との関係を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・カルシウム欠培地内での負の走温性を確認し、カラクシン、カルモジュリンの阻害による走温性発現精子の減少を明らかにした。
・継続して、走温性発現精子の移動性、方向の変化を調べ、速度、直線性、尾部屈曲の変化を確認した。
・走温性発現精子のカルシウムの変化、動態を解析し、高温度域における精子のカルシウム濃度の増大を確認した。
・電位依存性カルシウムチャネル、TRPCチャネル、細胞内放出チャネル、CatSper関連チャネルの阻害剤を添加し、精子の移動、方向を調べ、TRPCチャネル、細胞内放出チャネルの走温性における関与を確認した。
・受精能獲得前後における走温性と走化性の発現を調べ、受精能獲得との関係を確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．走温性の発現経路の解析：走温性発現精子の細胞膜流動性、カルシウム濃度の変化、分子薬理学的調節機構を調べる。
１）走温性発現精子の細胞膜流動性の解析：異なる温度勾配内で走温性発現精子の細胞膜流動性を比較、解析することで走温性の発現経路を探索する。２）走温性発現精子の細胞内カルシウム動態の解析：走温性発現精子の温度変化、および移動方向の変化に影響する、頭部から尾部におけるカルシウムの変動を解析する。温度勾配、温度変化、時間経過によるカルシウム濃度の変化、高濃度カルシウムの分布変化を計測することで、因子の受容部分、受容体、および発現経路を調べる。３）走温性発現精子におけるカルシウム作用機構の解明：カルシウム作用に関与するＴＲＰＶ４、およびカルシウムポンプの阻害剤あるいは促進・刺激剤である、４αＰＤＤ、ＲＮ１７３４、およびタプシガルギン、チメローザルを添加し、それぞれの作用に応じて精子の走温性を調べることで、カルシウムシグナル伝達機構を明らかにする。４）走温性発現精子の分子薬理学的調節機構の解明：複数の脱リン酸化、およびリン酸化に関与する酵素阻害剤を走温性発現経路に作用させ、走温性発現精子の分子薬理学的調節機構を明らかにする。脱リン酸化酵素阻害剤のカリクリンＡ、フォスファチジルイノシトールキナーゼ阻害剤のＬＹ294002、細胞膜透過性ＡＭＰＫ阻害剤：Compound Cを精子浮遊液に添加し、走温性を検査することで候補分子の薬理学的阻害機能を同定する。
２．走温性発現精子の受精機能の解析：走温性発現精子の超活性化運動、先体反応、発生能を調べる。
１）走温性発現精子の超活性化運動の解析：超活性化運動誘起前後の精子を温度勾配に導入し、走温性と超活性化運動の発現を調べる。２）走温性発現精子の受精能、発生能の解析：走温性発現精子をウシ卵子に媒精し受精率を調べる。
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| Causes of Carryover |
独自の事前研究機器、試薬、消耗品により継続して研究が推進できたため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は平成29年度請求額と合わせて、ガラス器具、プラスチック製品、酵素、発光試薬、蛍光試薬、凍結精液を購入し、利用する。
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