2015 Fiscal Year Research-status Report

蚊媒介性ウイルスの網羅的検査法および迅速検査法の開発

Research Project

Project/Area Number	15K07715
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	大場靖子北海道大学, 人獣共通感染症リサーチセンター, 講師 (60507169)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2019-03-31
Keywords	アルボウイルス / 蚊媒介性ウイルス
Outline of Annual Research Achievements	蚊媒介性ウイルスによる感染症は世界各地で問題となっており、今後も発生地域の拡大、感染者数の増加が懸念される。本研究では、蚊媒介性ウイルス感染症の迅速な診断法の確立、及び媒介蚊からウイルスを効率的に検出する方法を確立することを目的としている。本年度は、同属の蚊媒介性ウイルスの遺伝子をone-step RT-PCR法で同時に検出するために、フレボウイルス属、アルファウイルス属それぞれに属するウイルスに関して、遺伝子配列が比較的保存されている領域に対する共通プライマーを設計し、既知ウイルス遺伝子の検出感度を基にone-step RT-PCR法の至適条件を検討した。フラビウイルス属を検出する共通プライマーは既報の配列を参考に作製し条件決定を行った。また、蚊から抽出したtotal RNAにはPCR阻害物質が含まれることから、蚊由来RNA存在下での至適条件を検討した。新たに設計したフレボウイルス共通プライマーを用いて、Rift Valley fever virus, Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, Sandfly fever Naples virus, Forecariah virusのL遺伝子領域の増幅を確認した。Rift Valley fever virusは蚊由来RNA存在下でも反応液中約20コピーのウイルスRNAの検出が可能であった。アルファウイルス共通プライマーを用いたone-step RT-PCR法ではChikungunya virus, Sindbis virus の遺伝子増幅を確認した。本研究で確立した、フラビウイルス属、フレボウイルス属、アルファウイルス属を検出するRT-PCR法の条件を用いて、ザンビア等で採集した媒介蚊のスクリーニングを実施した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成27年度の研究実施計画に記載した、蚊媒介性ウイルス遺伝子を網羅的に検出するためのone-step RT-PCR法を確立するという計画通りに研究を実施し成果を得た。
Strategy for Future Research Activity	平成27年度に作製した蚊媒介性ウイルス検出のためのone-step RT-PCR法を用いて、野外採集蚊のウイルススクリーニングを継続する。既知または新規のウイルス遺伝子を検出したサンプルはウイルス分離試験によりウイルスの同定を試みる。共通プライマーを用いたone-step RT-PCR法に加えて、Dengue virus, Zika virus, Yellow fever virus, Chikungunya virus等の個々の蚊媒介性ウイルスに特異的なプライマーを用いたmultiplex real-time RT-PCR法の確立を試みる。また、蚊の乳剤および動物やヒト血清から、MAGPIXシステムにより多種のウイルス粒子またはウイルス抗原を同時にスクリーニングするアッセイ系の確立を試みる。
Causes of Carryover	試薬品、器具類を予定より安値で購入し、本年度の解析サンプル数（蚊の捕獲数）が予定より少なかったことから物品費の未使用額が生じた。参加予定の学術集会が平成27年度内に開催されず平成28年4月開催であったことから旅費計上分が未使用となった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度使用額より、4月の国内学会への旅費、4－6月に解析予定の研究に必要な物品費として使用。