2016 Fiscal Year Research-status Report
犬の肥満細胞腫における新たな分子標的候補遺伝子に関する基礎的な検討
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15K07736
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| Research Institution | Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine |
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Principal Investigator |
富張 瑞樹 帯広畜産大学, 畜産学部, 准教授 (00552754)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 肥満細胞腫 / 犬 / 家族性発症 / 分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
犬の肥満細胞腫は皮膚に発生する悪性腫瘍の中で最も一般的に認められ、とくに高グレードのものでは明瞭な予後因子の特定が難しいこと、さらには治療への反応性も乏しい難治性疾患として広く知られている。
これに対し我々は、同腫瘍の家族性発症が疑われる症候群に遭遇し、DNAマイクロアレイ解析により発現に異常を認める新たな9種の候補遺伝子を得た。一方、Giantinら（2014）は自然発症した犬の肥満細胞腫51症例に対し同様のアレイ解析を行い、前述の9種とは全く異なる13種の候補遺伝子を報告し、このうち4種においては発現量と生存率に明確な相関が認められたことを報告している。しかしながらこれらの候補遺伝子が、実際の家族性発症の原因となる因子であったかどうか、あるいは腫瘍組織中でどのような役割を果たしているのか、については全く明らかとされていない。
そこで我々は、上述21種の候補遺伝子について、犬の肥満細胞腫腫瘍組織における発現動態をより詳細に解析するために、まずはmRNAレベルの定量を行った。
平成27年度までに確立された測定系を用い、家族性発症犬２頭を含む肥満細胞腫症例14症例について、上述の候補遺伝子を対象としてmRNA遺伝子発現量の解析を行った。またこれと並行して、帯広畜産大学動物医療センターに来院された自然発症の肥満細胞腫症例犬から病気ステージに応じた計時的な腫瘍組織の採材を行った。また多角的な評価を考慮し、肥満細胞腫以外の腫瘍罹患犬からの腫瘍組織の採材も行った。
平成28年度以降では、これらの症例数をさらに増やし同様の解析を進めるとともに、解析結果を踏まえて候補遺伝子をさらに絞り、有用性の高いものを対象として、mRNA遺伝子配列に対するダイレクトシーケンスや、タンパク質レベルでの発現解析などについて、より詳細な検討を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度までで、①候補遺伝子の選定（家族性発症に関連性の疑われる９種、Giantinらが報告した肥満細胞腫に関連性の高い４種、内部標準３種の計16種）、測定系の確立、②犬肥満細胞腫の自然発症症例の採材、③mRNA発現量の解析を行った。
平成28年度では、②と③について継続した採材、解析を行った。肥満細胞腫症例として、家族性発症犬２頭を含む14頭の腫瘍組織を採材し、解析を行った。この結果、DNAアレイ解析結果からポジティブ遺伝子と考えていた7種の遺伝子のうち、PPP2R1AならびにCD3Eで、家族性発症犬において顕著な増加傾向が認められた。またネガティブ遺伝子と考えていた２種の遺伝子のうち、C6において顕著な減少傾向が認められた。また、ポジティブ遺伝子と考えていたPRKCEについて、症例数を増やして検討をくわえたところ、自然発症犬において顕著に減少していることが確認された。
一方で、Giantinらの報告した４種については、自然発症犬とその他の肥満細胞腫症例犬において、有意な差異は認められなかった。
上記結果は、単純にmRNA発現量を比較したのみであり、病期ステージや病理のグレードなどを含めた総合的な解析については十分に検討できていない。また家族性発症に関連が疑われる犬種特異性（短頭種vsその他の犬種に対する精査）についても今後、詳細な検討を加える必要がある。
さらに、これらの候補遺伝子について多角的な視点から評価することを目的として、その他の腫瘍発症犬においても同様の腫瘍組織採材を行った。現在15症例の採材を行っており、腫瘍特異性についての検討を考慮し、今後も継続して症例数を増加させる必要があると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）昨年度までの②自然発生症例における腫瘍組織の採材、③mRNA発現解析については、今年度も症例数増加を目的に、収集、解析を継続する。昨年度に予定していた他大学、また近隣の動物病院との連携、採材についても積極的に推進する。病期ステージに応じた複数回の腫瘍組織採材についても、症例数増加を目的とし、継続して行う。
２）有用性の高い候補遺伝子をさらに絞り込む。この候補遺伝子に対し、とくに家族性発症を認めた症例群において、mRNA（具体的にはcDNA）について、ダイレクトシーケンス法にて遺伝子配列の解析を行う。コントロールとしてその他症例群（肥満細胞腫）のcDNAについても解析を進め、なんらかの変異（アミノ酸配列に影響する、ストップコドン挿入など）が認められた場合には、その変異の様式について慎重に検討した上で、組織もしくは全血由来のgenomic DNA 上における遺伝子配列の解析もあわせて試みる。また一方で、これらの候補遺伝子が肥満細胞腫に特異性の高い発現動態であるかどうかを評価するために、肥満細胞腫以外の腫瘍組織に対して同様の解析を行い、比較検討する。この場合、その他の腫瘍についてもある程度十分な症例数が必要になるものと考えられるため、１）と同様に精力的な収集を行う。
３）遺伝子配列における異常が明らかになった場合を想定し、さらなる検討を進めるために、肥満細胞腫自然発症犬から確立された培養細胞を入手し、まずこれら培養細胞における上記候補遺伝子の発現解析を行う。具体的にはmRNA発現量、次にタンパク質の発現動態、さらには異常タンパク質の形質導入について、実現可能性を含めて検討、解析を行う。
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Research Products
(1 results)
