2015 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子挿入のない安全なイヌ・ネコiPS細胞を用いた赤血球分化誘導の検討
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15K07747
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (40453138)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉浦 喜久弥 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (30171143)
竹中 重雄 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (10280067)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / センダイウイルスベクター / イヌ / ネコ / 再生医療 / 再生獣医療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イヌとネコのiPS細胞の臨床応用に向けて遺伝子挿入のない持続発現型RNAウイルスベクターであるセンダイウイルスベクター（SeVdp）を用いた方法により、ネコおよびイヌiPS細胞の作製を試みた。
①イヌおよびネコの胎子線維芽細胞にSeVdpを用いてGFP遺伝子を導入し、その発現を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、細胞にGFPの発現が確認でき、遺伝子導入時のウイルス力価に依存してGFP発現細胞数の増加が見られた。
②イヌおよびネコの線維芽細胞にヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの4遺伝子を感染力価および温度条件を変えて導入し、各条件におけるSeVdpの感染効率を免疫染色により調べた。その結果、ウイルス力価に依存して感染率が上昇し、MOI=7以上の力価でプラトーに達した。また低温で遺伝子導入を行うことで、SeVdpの感染効率が向上することがわかった。
③4遺伝子を導入した胎子線維芽細胞をノックアウト血清代替物（KSR）またはウシ胎子血清（FBS）を加えたヒトES細胞培地で、マイトマイシンC処理マウス胎子線維芽細胞と共培養した。その結果、FBS群に比べてKSR群でiPS様細胞の初代コロニーが多数出現し、そのコロニーは未分化マーカーであるALPに陽性を示した。
以上のことから、SeVdpを用いた遺伝子導入により、イヌおよびネコiPS様細胞コロニーを得ることに成功した。さらに、ネコiPS様細胞では長期間継代可能な細胞株が得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
イヌとネコの線維芽細胞にSeVdpを用いて初期化遺伝子を導入することに成功した。また、感染させる時のウイルス濃度や温度条件を変えることにより、遺伝子導入効率の高い条件を発見することができた。
その後、4遺伝子を導入した胎子線維芽細胞を培養することにより、iPS様細胞のコロニーが出現し、これらはALP陽性であったことから細胞の初期化が起こったと判断できる。以上のことから、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回得られたイヌとネコiPS様細胞は、センダイウイルスが導入されたままであるため、今後、siRNA処理などにより、センダイウイルスを除去した細胞株を作製する。
また、得られたiPS細胞に対するコントロールとしてES細胞も必要となることから、ネコES細胞の作製も並行して行う。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた状況としては、iPS細胞の大量培養に必要となる培養用プラスチック製品や、各種のサイトカイン、シグナル活性化因子や阻害因子などの低分子化合物を用いた研究がまだおこなわれなかったことが要因の一つである。これらの試薬は非常に高価であるため、次年度にはこれらの試薬を購入することになる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、イヌとネコiPS細胞の特性解析や長期培養を行う予定である。さらに、これらのiPS細胞から血液細胞へ分化させる研究を始めることになっている。これらの研究には、培地に添加する多くの試薬、抗体が必要となるため、これらの試薬の購入に多くの研究費を使用する予定である。
また、得られた研究成果は学会等で積極的に発表するため、旅費としても一部使用する。
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