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2016 Fiscal Year Research-status Report

遺伝子挿入のない安全なイヌ・ネコiPS細胞を用いた赤血球分化誘導の検討

Research Project

Project/Area Number 15K07747
Research InstitutionOsaka Prefecture University

Principal Investigator

鳩谷 晋吾  大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (40453138)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 杉浦 喜久弥  大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (30171143)
竹中 重雄  大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (10280067)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
KeywordsiPS細胞 / センダイウイルスベクター / イヌ / ネコ / 再生医療 / 再生獣医療
Outline of Annual Research Achievements

前年までに、細胞質内で遺伝子を発現して染色体を傷つけないより安全なベクターとされているセンダイウイルスベクター(SeVdp)を用い、イヌとネコのiPS様細胞コロニーを得ることに成功したが、その作製効率は低く、SeVdpの除去もできていない。そのため、本年度はiPS細胞コロニー形成の効率化およびSeVdpの除去を試みた。その結果、以下のような結果が出ている。
①ネコ胎子線維芽細胞にSeVdpを用いて、多能性関連遺伝子であるヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの4因子を導入後、フィーダー上に播種し、ヒト胚性幹細胞培地を用いて培養した。その結果、扁平型の形態を示すiPS細胞様コロニーが出現した。得られた細胞は、30継代以上の長期継代が可能であり、各種未分化マーカーは陽性であった。さらに浮遊培養によって胚様体を形成し、その後の接着培養で三胚葉マーカーに陽性を示すと共に、一部の細胞は拍動する心筋細胞へ分化した。siRNA処理によるSeVdp除去を確認できたが、除去後の細胞は、長期間継代培養することができなかった。
②上記の方法では、ネコiPS様細胞コロニーの作製効率が低いため、SeVdpを感染させた細胞にTGFβ阻害剤を添加すると、その作製効率は有意に増加することがわかった。
③イヌ胎子線維芽細胞に同様にSeVdpを用いて遺伝子導入することで、ヒトiPS細胞の類似した細胞コロニーが得られた。この細胞は、各種未分化マーカーに陽性を示した。また、ネコと同様にTGFβ阻害剤を添加すると、その作製効率は有意に増加することがわかった。さらに、一部のイヌiPS様細胞はウイルスの除去が可能であったが、その後、イヌiPS細胞の培養維持が難しくなった。
以上のことから、イヌおよびネコにおいて、効果的にiPS様細胞のコロニー形成ができるようになった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

センダイウイルスベクター(SeVdp)を用い、イヌとネコのiPS細胞の作製に取り組み、効率的にiPS細胞コロニーを形成できるようになった。また、これらの細胞は、未分化であり、各種細胞へ分化できることがわかった。さらに、イヌおよびネコiPS様細胞からSeVdpを除去できることがわかった。
しかしながら、SeVdp除去後に各細胞を安定的に培養できておらず、やや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

さらに、iPS細胞の作製効率改善を図るため、導入する遺伝子数の検討を行う。また、SeVdp除去後に長期培養が可能となるように、シグナル活性化因子や阻害因子などの低分子化合物や各種のサイトカインを検討する。
さらに、iPS細胞から各種血液細胞へ分化させるための検討も始める。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由としては、iPS細胞からセンダイウイルスを除去後、iPS細胞を大量培養し、さらに血液細胞に分化させる研究をする予定であったが、当該年度までには、大量培養研究まで進まなかったためである。特に、iPS細胞培養には、培養用のプラスティック製品や、サイトカイン、低分子化合物など高価な試薬が多いため、次年度でこれらの購入を考えている。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は、iPS細胞の大量培養および血液細胞への分化誘導を行う予定である。これらの研究では、培地に添加するためのサイトカインや、分化細胞の性質をしらべるための抗体などが多数必要となる。そのため、これらの試薬の購入に多くの研究費を使用する。
さらに、得られた研究成果は学会等で積極的に発表するため、旅費としても一部使用する。

  • Research Products

    (8 results)

All 2017 2016 Other

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (6 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 3 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Feeder-independent canine induced pluripotent stem cells maintained under serum-free conditions.2017

    • Author(s)
      Nishimura T, Hatoya S, Kanegi R, Wijesekera DPH, Sanno K, Tanaka E, Sugiura K, Hiromitsu Tamada NK, Imai H, Inaba T.
    • Journal Title

      Mol Reprod Dev

      Volume: 84 Pages: 329-339

    • DOI

      doi: 10.1002/mrd.22789

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 犬iPS細胞の基礎研究とその問題点2017

    • Author(s)
      鳩谷晋吾
    • Organizer
      日本再生医療学会
    • Place of Presentation
      仙台国際センター(宮城県仙台市)
    • Year and Date
      2017-03-07 – 2017-03-09
    • Invited
  • [Presentation] 獣医再生医療における幹細胞の役割とは2017

    • Author(s)
      鳩谷晋吾
    • Organizer
      日本獣医再生医療学会
    • Place of Presentation
      名古屋プライムセントラルタワー(愛知県名古屋市)
    • Year and Date
      2017-02-11 – 2017-02-12
    • Invited
  • [Presentation] 幹細胞療法適応の展望と課題2017

    • Author(s)
      鳩谷晋吾
    • Organizer
      日本獣医再生医療学会
    • Place of Presentation
      名古屋プライムセントラルタワー(愛知県名古屋市)
    • Year and Date
      2017-02-11 – 2017-02-12
    • Invited
  • [Presentation] ネコiPS細胞株のセンダイウイルスベクターを用いた作製2016

    • Author(s)
      沖田良太、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、大高真奈美、西村健、中西真人、稲葉俊夫
    • Organizer
      第159回日本獣医学会学術集会
    • Place of Presentation
      日本大学(神奈川県藤沢市)
    • Year and Date
      2016-09-06 – 2016-09-08
  • [Presentation] イヌ体細胞を用いた人工誘導胚体外内胚葉細胞の作製と肝細胞への分化誘導2016

    • Author(s)
      畦崎直哉、西村俊哉、金城綾二、Himali Wijesekera、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、川手憲俊、玉田尋通、今井裕、稲葉俊夫
    • Organizer
      第159回日本獣医学会学術集会
    • Place of Presentation
      日本大学(神奈川県藤沢市)
    • Year and Date
      2016-09-06 – 2016-09-08
  • [Presentation] GENERATION OF MULTIPOTENT CANINE EXTRAEMBRYONIC ENDODERM-LIKE CELLS VIA THE FORMATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS.2016

    • Author(s)
      Unezaki Naoya, Nishimura Toshiya, Kanegi Ryoji, Wijesekera Daluthgamage Patsy Himali, Sugiura, Kikuya, Hatoya Shingo, Kawate Noritoshi, Tamada Hiromichi, Imai Hiroshi and Inaba Toshio
    • Organizer
      the International Society for Stem Cell Research(ISSCR) 2016 Annual Meeting (国際学会)
    • Place of Presentation
      サンフランシスコ
    • Year and Date
      2016-06-22 – 2016-06-25
    • Int'l Joint Research
  • [Remarks] 研究室ホームページ

    • URL

      http://www.vet.osakafu-u.ac.jp/cell/

URL: 

Published: 2018-01-16  

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