心臓におけるβ3交感神経受容体の発現解析および心筋線維化に関わる機序の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07751
• Research Institution: Rakuno Gakuen University
• Principal Investigator: 堀 泰智 酪農学園大学, 獣医学群, 准教授 (20406896)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 心不全 / 心臓線維化 / 交感神経受容体 / β3受容体 / 心臓線維芽細胞

Outline of Annual Research Achievements

交感神経受容体(AR)にはαとβのサブタイプがあり、β-ARには3つのサブタイプ(β1, β2, β3-AR)が存在している。β-ARの慢性的な刺激は心肥大や心筋線維化を誘起することから、β-ARは心不全の進展に深く関わっている。この内、β3-ARは脂肪細胞や平滑筋に多く発現しているため、当初は肥満や糖尿病の治療薬として注目されていたが、近年では心血管系におけるβ3-ARの局在が明らかとなり、生理学的機能や心不全の病態との関連性が注目されている。しかし、①心臓線維芽細胞におけるβ3-ARの局在は知られておらず、②β3-ARを介したコラーゲン産生の調節機序は未だ解明されていない。従って、心筋線維化のメカニズムは十分に解明されておらず、③心不全におけるβ3-ARの病態生理学的意義は未知のままである。本研究では、β3-ARを介した心筋線維化のメカニズムを解明し、新たな心不全治療薬の開発に向けた基礎的情報を発信することを目的としている。
初年度には、ラットの心臓ならびに心臓線維芽細胞におけるβ3-ARの発現解析を行い、ラットの左心室におけるβ3-ARのmRNA・蛋白発現は極めて少なく、心臓線維芽細胞では顕著に発現していることを明らかにした。
この結果を踏まえ、平成28年度にはβ3-AR 作動薬(BRL37344)を使用し、β3-ARを介した細胞内シグナルの伝達経路を探索すると共に、コラーゲン産生に対する影響を解析した。本剤に暴露した心臓線維芽細胞では濃度依存性にp44/42 MAPK (ERK1/2)のリン酸化が増加しており、10-4Mでは最も強いシグナルが確認された。また、継時的変化の解析では、本剤添加後10分でリン酸化ERK1/2の最も強いシグナルが認められた。
これらの結果から、心臓線維芽細胞におけるβ3-AR刺激は同受容体を介して細胞内シグナルを調節していることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究ではin vitro研究およびin vivo研究から、①心臓線維芽細胞におけるβ3-ARの遺伝子・蛋白質の発現解析、②β3-ARを介したコラーゲン産生の調節メカニズム解析、③心不全モデルラットにおけるβ3-ARを介した心筋線維化ならびに心機能の調節機序の解析を行い、β3-ARを介した心筋線維化のメカニズムを明らかにすることで、心不全治療の発展に向けた新たな基礎的情報の解明を目標としている。
我々は昨年度までにラット心臓線維芽細胞においてβ3-ARが発現している事を明らかとしており、本年度ではβ3-AR作動薬(BRL37344)を用いて心臓線維芽細胞のβ3-ARを刺激することで、心臓線維化に関わる細胞内シグナル及びコラーゲン発現の変化を分子生物学的に評価した。本剤に暴露したラット心臓線維芽細胞では濃度依存性(10-6～10-4M)にp44/42 MAPK のリン酸化が増加しており、10-4Mでは最も強いシグナルが確認された。また、継時的変化(10-4M; 0、10、30、60、120 min)を解析したところ、本剤添加後10分ではリン酸化ERK1/2の最も強いシグナルが認められた。これらの結果から、心臓線維芽細胞におけるβ3-AR刺激は同受容体を介して細胞内シグナルを調節していることが示唆された。しかし、コラーゲンの発現量には有意な変化は認められなかった。このことは、細胞内でコラーゲンが産生されるまでには約24時間が必要であり、本研究のプロトコールではコラーゲンの発現変化を捉えることが出来なかったと推察される。
これらのことから当初計画にあった平成28年度の目標はやや遅れていると判断している。今後は、心臓線維芽細胞におけるβ3-ARとコラーゲン産生に関わる直接的関連性を解析すると共に、心臓線維化に関わる様々な細胞機能の解明が必要であると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

平成27～28年度に実施した研究結果では、心臓線維芽細胞においてβ3-ARのmRNA・蛋白質発現を確認し、β3-AR作動薬によって細胞内シグナルが変化することを明らかとした。これらのことは心臓線維芽細胞におけるβ3-ARの生物学的機能を解明するための基礎的情報であり、本研究を遂行する上でも重要な意味を持っていると考える。
平成29年度にはβ3-ARを介したコラーゲン産生の調節機序を解明するために、ウェスタンブロット法を用いてさらに詳細な細胞内シグナルの変動を明らかにするとともに、I型コラーゲンの発現量の変化や細胞増殖、分化、アポトーシス、肥大などに関する蛋白の機能解析を行い、β3-ARの生物学的機能ならびに心臓線維化との関係を解明する計画である。また、心不全ラットモデルを作製し、心機能とβ3-AR刺激の関係を解析することで、新たな心不全治療の開発に発展できる可能性を模索する。

Causes of Carryover

平成28年度には、心臓線維芽細胞におけるβ3-ARを同定するためのPCRプライマーやウェスタンブロットで使用する1次抗体を始め、消耗品を多く支出している。また、次年度に予定している「心不全モデルラットにおけるβ3-ARを介した心筋線維化ならびに心機能の調節機序の解析」に向けた各種備品・試薬を購入し、予備実験が進行していることから、当初の計画通りに研究は遂行されている。さらに、昨年度に研究代表者の所属が変更したことを受け、研究に必要な電子天びんならびに分析用電子天秤を新たに購入する必要が生じている。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成29年度にはβ3-ARの持つ細胞機能を解析するために、β3-ARの作動薬や阻害薬が必要不可欠である。また、ERK1/2やCREBなどの各種細胞内シグナルの分析に用いる1次抗体や2次抗体、ウェスタンブロットに必要な試薬などの消耗品を支出する。さらに、研究代表者の所属が変わったことから試薬の調整に不可欠な電子天びん(140,000円)、分析用電子天秤(165,000円)を購入する必要がある。