2015 Fiscal Year Research-status Report

喉頭の化学受容細胞－神経複合体による呼吸防御反射機構の解明

Research Project

Project/Area Number	15K07759
Research Institution	Iwate University
Principal Investigator	山本欣郎岩手大学, 農学部, 教授 (10252123)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	喉頭 / 化学受容 / 呼吸 / 免疫組織化学 / カルシウムイメージング / ラット
Outline of Annual Research Achievements	実験動物としてラットを用い、喉頭粘膜における化学受容細胞の形態とその神経支配について検索した。その結果、喉頭粘膜にはα-gustducin陽性の孤在性化学受容細胞とSNAP25陽性の神経内分泌細胞の2種類の細胞が存在していることが明らかとなった。また、喉頭蓋および披裂喉頭蓋ひだ付近の重層扁平上皮の部分では、両細胞がクラスターを形成し、味蕾様構造を形成することがわかった。これらの感覚神経支配を検討したところ、いずれもcalcitonin gene-related peptide (CGRP)およびsubstance P (SP)陽性の細い神経終末と接触していること、P2X3 ATP受容体陽性の軸索末端部が扁平に拡がる神経終末に囲まれることがわかった。これらの神経は、孤在性に分布する細胞においても味蕾様構造においても分布が認められた。CGRP陽性神経終末およびSP陽性神経終末は侵害受容に関与する迷走神経由来のC線維と考えられた。一方で、P2X3陽性神経終末は化学受容細胞が分泌するATPによって興奮することが予測され、化学受容細胞が受容する刺激を中枢に伝達する際にATPが重要な役割を有することが示唆された。さらに、ATP陽性神経終末の軸索末端部には小胞性グルタミン酸トランスポーター(vGLUT1、vGLUT2、vGLUT3)が存在することが判明し、P2X3陽性神経終末は求心性のみならず遠心性に化学受容細胞を含む上皮細胞の機能を調節していることが示唆された。さらに、声門下腔には、微絨毛蛋白の一種であるvillin陽性の散在性細胞が多く認められた。Villin陽性細胞の性質は十分明らかになっていないが、CGRP陽性神経終末およびSP陽性神経終末との接触が認められることから感覚上皮細胞のサブクラスである可能性がある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成27年度に、喉頭粘膜における形態学的分類と化学受容細胞－神経複合体としての神経化学的特徴を明らかにして論文等で公表することができた。これらの形態学的解析の途上で、これまでに孤在性化学受容細胞と同一視されていたvillin陽性の刷子細胞が喉頭粘膜では全く異種の細胞であることがわかり、化学受容細胞であるか否かの検討を含めてさらに形態学的解析を進めることとした。化学受容細胞のカルシウムイメージングでは、形態学的解析により化学受容細胞が披裂軟骨を覆う粘膜に多く存在することを基に、同部位のスライスイメージングを行なうこととした。ラットを腹大動脈で放血殺後披裂軟骨部を剪刀で切り出し、マイクロスライサーを用いて100 μmの厚さのスライス標本を作製した。寒天包埋を行なうことにより、効果的に試料作成することが可能であった。これらの標本にFluo-4, AMを負荷して共焦点レーザー顕微鏡でタイムラプス記録を行なった。予備実験として、鼻粘膜呼吸部および気管粘膜の化学受容細胞での報告を参考として、刺激物質としての有力候補である苦味物質に対する反応性を検討した。スライス標本に1mMのキニーネ（苦味物質）を添加したところ、標本上にいくつかの細胞で細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を認めた。しかしながら、今回のイメージング実験の条件では細胞のサブクラスを同定するには解像度が十分でないこと、免疫組織化学による細胞同定では抗体浸透が十分でないことがわかり、細胞同定法にはさらに工夫が必要であるという課題が残った。電気生理学的実験では、生体の活動を記録するための予備実験を行なった。高感度増幅器を用いて、ステンレス双極電極による前喉頭神経の記録、圧電センサによる呼吸および心拍の記録、双極針電極による肋間筋筋電図の記録、大腿動脈カニューレによる血圧の記録が可能であることを確認した。
Strategy for Future Research Activity	喉頭化学受容細胞の形態学的分類および化学受容細胞―神経複合体における感覚神経の神経化学的特徴の項では、未解決のvillin陽性細胞の分布と免疫組織化学的特徴、感覚神経支配を検索することにより、喉頭粘膜における3つ目の化学受容細胞のサブタイプであるか否かを明らかにする。平成28年度は、喉頭化学受容細胞のカルシウムイメージングを中心に解析する。前年度にカルシウムイメージングの基本的な実験のセットアップが終了したので、共焦点レーザー顕微鏡のパラメータの詳細な設定を行なう。刺激溶液として、浸透圧変化、二酸化炭素、味物質（甘味、塩味、苦味、酸味、うま味）を用い、化学受容細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を検討する。また、細胞の同定には課題点が残るため、厚い標本をそのまま免疫組織化学に供するのみでなく、クリオスタットによりさらに10－20 μmの連続薄切標本を作成して免疫組織化学をする等の改良を行なう。以上により、α-gustducin陽性の孤在性化学受容細胞およびSNAP25陽性の神経内分泌細胞の反応特性を明らかにする。状況に応じてvillin陽性刷子細胞も検討事項に加える。喉頭化学受容細胞により生じる反射の電気生理学的検索では、基本パラメータの取得が可能であることがわかったので、喉頭粘膜への刺激方法を検討する。具体的方策として、気管呼吸として上行性に気管から鼻腔に向けて刺激溶液を還流する方法を試行し、カルシウムイメージングの結果を受けて本実験を開始する。