2016 Fiscal Year Research-status Report
Clarification of molecular mechanisms that are involved in onset of epilepsy, depression, and anxiety.
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15K07774
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
加藤 啓子 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90252684)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 喜明 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (40512455)
黒坂 光 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90186536)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | シアル酸転移酵素 / シアル酸 / てんかん / うつ / 不安症 / 糖鎖構造 / 視床 / 疾患モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
てんかん患者における，うつ，不安障害，統合失調症といった精神疾患の出現は，一般の集団に比べて３倍高いことが知られている。研究者は，難治てんかんの５０％を占める側頭葉てんかんのモデルマウスを用いた研究より，辺縁系神経細胞におけるシアル酸転移酵素（ST3Gal4）の発現が，てんかん発作誘導に必須である一方で，その欠失は，うつ，不安障害，統合失調症様症状を引き起こすことを明らかにしてきた。このST3Gal4がシアル酸を付加する分子が，てんかんから，うつ，不安障害，統合失調症様症状の発症に関わると考え，本研究では，シアル酸標的分子を同定し，てんかんとその併存症の発症に関わる分子シグナルの全貌をめざす。
昨年度は，ST3Gal4の発現を示す神経細胞が特異的に提示する糖鎖構造を検出・同定した。これまでに，ST3Gal4の発現が高い視床内側膝状体において，ST3Gal4遺伝子欠損マウスと野生型とで異なる糖鎖構造を見つけることに成功した。その際，糖脂質の末端ではなく糖タンパク質の末端のシアル酸を付加することを示唆する結果を得た。そこで平成28年度は，特異的糖鎖構造を持つシアル酸化糖タンパク質をスクリーニングするために，CRISPER/CAS系を用いたゲノム編集により，ST3Gal4のExon3にmCherryを挿入することで，ST3Gal4の発現調節を受けたmCherryを発現する， ST3Gal4酵素を欠損したSt3gal4_mCherryマウスの作成を試みている。また，ST3Gal4酵素によりシアル酸化される糖タンパク質（受容体基質）を同定するため，ST3Gal4酵素遺伝子とその活性基を潰したミュータント酵素遺伝子の発現ベクターを構築している。最終年度には，ヒト培養細胞で酵素とそのミュータントを精製し，St3gal4_mCherryマウス脳から受容体基質のアフィニティー精製を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
最終年度に向けて，材料を調整しているところであるため，未だ新たな結果を得るところには至っていない。しかしながら，平成29年度の完成に先駆け，以下の準備が整ってきた。具体的には，① アジド糖ManNAzを注入した海馬，視床の凍結脳を，-80Cに保存できている。次に，② CRISPER/CAS系によるゲノム編集により，ST3Gal4の発現調節を受けたmCherryを発現する，ST3Gal4酵素を欠損したSt3gal4_mCherryマウスの作成が進んでいる。現在，ターゲット遺伝子及び，sgRNAとCAS9を含むベクターを用いることで，ターゲット遺伝子を相同組み換えした候補ES細胞クローンを採取した。それらクローンのゲノム上にターゲット遺伝子が挿入されているかについて，シークエンスを読み最終確認をしている。現在シークエンスの確認が終わった段階であり，今後ES細胞の核の性状を観察し，最も状態の良いES細胞クローンを胚盤胞に植えたのち仮母の子宮に返し，キメラマウスを作成する予定である。最終的に作成できるモデルマウスとして，St3gal4_mCherryマウスと，これまで使ってきたSt3gal4遺伝子欠損マウスあるいは，同腹子野生型マウスを交配することで，以下の２種のマウスを作成する。St3gal4_ mCherry (-/-) マウスは，mCherryを持つニューロンがST3Gal4酵素を持たないマウスであり，St3Gal4_ (+/-) は，St3Gal4酵素とmCherryを共に発現するニューロンを持つマウスである。③ ST3Gal4酵素遺伝子とその活性基を潰したミュータント酵素遺伝子の発現ベクターを構築しており，５月末には完成できる。そして夏までには精製したST3Gal4酵素と，そのミュータント酵素が調整できる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度に予定していた，受容体基質タンパク質のスクリーニングを１年繰越し，平成29年度に実施する。ST3Gal４は，刺激応答性に発現するシアル酸転移酵素であり，脳内の発現分布も非常に特徴的であり，特に視床の感覚系神経核及び，海馬からの投射を受ける（マウス）視床前核のニューロンで発現を示す。それゆえ，ST3Gal4の受容体基質をスクリーニングするには，ST3Gal4を発現する特定のニューロンを集める必要があることに気づいた。そこで，ST3Gal4の発現調節を受けたmCherryを発現する，ST3Gal4酵素を欠損したSt3gal4_mCherryマウスを作成することとした。St3gal4_mCherry(-/-) マウスとSt3Gal4_ (+/-) マウスは，7月には完成予定である。そこで，各St3gal4_mCherryマウス脳から視床を中心に神経細胞を単離し，セルソーターを用いることで，mCherryの蛍光を持つニューロンを分画し，可溶化タンパク質を得る。一方で，平成27年度に確立した方法より，海馬や視床へのアジド糖ManNAzの注入と注入後の糖タンパク質を回収する際，平成29年度は，St3gal4_mCherryマウスを用いることで，ManNAzでラベルされたST3Gal4発現細胞について，受容体基質をスクリーニングする。さらには，St3gal4_mCherryマウス脳ニューロンを対象に，夏までには精製したST3Gal4酵素と，そのミュータント酵素と結合する受容体基質をスクリーニングすることができる予定である。
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