多能性幹細胞を糖鎖で制御－多能性の維持・分化は糖鎖生合成経路の改変で得られるか？

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07786
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 相川 順一 国立研究開発法人理化学研究所, 伊藤細胞制御化学研究室, 専任研究員 (10260192)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 多能性幹細胞 / ES細胞 / 糖鎖 / ゴルジマンノシダーゼ / レチノイン酸

Outline of Annual Research Achievements

（目的）
本研究課題は再生医療の重要な材料である多能性幹細胞を取り扱う。再生医療には多能性幹細胞が必要である。その上、再生医 療のコアは、胚性幹細胞（ES細胞）と人工多能性幹細胞の樹立、維持である。幹細胞の多能性の維持には、分泌性蛋白質が必要である。幹細胞自身が分泌する内因性の蛋白質の多くは、アスパラギン結合型糖鎖を持つ糖蛋白質である。また、肝細胞表面に局在する、分泌性蛋白質の受容体の多くも糖鎖を 持つ糖蛋白質である。そこで、本研究課題はアスパラギン結合型糖鎖の生合成を制御することで、多能性幹細胞の未分化維持に関する知見を得ることを目的とする。詳述すると、多能性幹細胞研究の現状から導いた、「多能性幹細胞の未分化の維持は、分泌性の蛋白質因子やそのレセプターの糖鎖がハイマンノース型であることが必然」という仮説を、申請者の駆使する研究手法により検証し、発展させることを本研究課題の目的とする。
（平成２８年度）
（１）ES 細胞でのマンノシダーゼ阻害剤の添加による細胞の性状および糖鎖構造への影響を解析する：マンノシダーゼ阻害剤キフネンシンはマウスゴルジマンノシダーゼIA(mMAN1A1)の活性も阻害する。レチノイン酸の添加によりES細胞を分化させる系で、キフネンシン添加による影響を探求した。その結果、細胞形態ではレチノイン酸添加後に顕著な変化は見られなかった。また、キフネンシンの代わりにRNAiの手法により、mMAN1A1の発現抑制を行ったが、同様であった。
（２）ES細胞の分化系におけるnon-coding RNAの発現：mMAN1A1の転写開始点上流領域に見いだされたESTがnon-coding RNAであり、mMAN1A1の発現に関わる可能性を検討した。そこで、RT-PCR法により発現パターンを調べた。その結果、予想される転写物の一部の領域の発現が、分化前後で異なっていた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究課題実施中に情報が明らかになり、その意義が重要なmMAN1A1のnon-coding RNAに関する研究に着手したため、当初平成２８年度に予定していた「糖鎖の調製、標識、解析」が遅延している。

Strategy for Future Research Activity

平成２８年度に得られた知見を基に、mMAN1A1におけるnon-coding RNAの機能を探る。具体的には、non-coding RNAの全長の単離と、RNAi法を駆使した機能解析を行う。また、強制発現、阻害剤、RNAIの手法により得られる糖鎖サンプルを順次解析し、（１）ES細胞の形状、（２）mMAN1A1の発現、（３）糖鎖構造の三者間の関係について、明らかにする。

Causes of Carryover

平成２８年度に実施する予定であった、糖鎖の調製、標識、解析の実施が遅延しているため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成２９年度に前年度実施予定であった、糖鎖の調製、標識、解析を行う。