2016 Fiscal Year Research-status Report
カイコガを利用した体内受精型動物の精子成熟機構の解明
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15K07793
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
長岡 純治 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 助教 (00303933)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 精子成熟誘発因子 / 精漿タンパク質 / 精子タンパク質 / リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題①：in vitroでの精子成熟再現系に含まれるタンパク質を二次元電気泳動により解析することで，7つの候補タンパク質を見出した。そして，これらのタンパク質のN末端を決定し，これに基づき，コードする遺伝子の単離を行った。予想される配列からは，切断部位がInitiatorinの切断特異性と一致していることが確認できた。これにより，基質タンパク質としての可能性を強く確認できた。単離された遺伝子は生殖腺での発現解析ならびに大腸菌でのタンパク質発現を行ない，後者は，抗体作成の供した。それぞれのタンパク質に対して特異性をもつ抗体は，タンパク質の動態解析に用いた。なお，これらのタンパク質はオス生殖腺の分泌物であるので，精漿に存在するタンパク質と予想されたが，2種類は，未成熟な精子に吸着して存在しており，精子成熟によりInitiatroinの作用を受け，分解されると精子から放れ，精漿へと移動することを見出した。また，4種類については，お互いに相互関係を持ちながら精漿に存在している可能性を見出した。
課題②： 精子内シグナル伝達の解析
in vitro精子成熟再現系において，反応開始に伴い精子を構成するタンパク質のチロシンリン酸化が変化する。今回，in vivoにおいても同様な変化が起きていることを確認するために，精包内精子を単離する方法を構築し，単離された精子のリン酸化を調査し，確認した。次に，リン酸化タンパク質の種類，リン酸化部位を同定するために，二次元電気泳動により当該タンパク質が分離できるように検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Initiatorin候補基質タンパク質を複数見出すことに成功し，予定よりも早い進捗であった。しかし，配列からは機能予測ができなかったので，研究方針を変更する必要が生じ，後半，来年度以降の実験展開のための探索に時間を必要とし，同時に，予算使用の工夫が生じた。
一方、精子成熟に係わるチロシンリン酸化解析については、確実な進捗である。また，人工授精に関しても，現時点では顕著な結果は得られていないものの，実験系としては進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題①：精漿・精子に存在する未知なInitiatorin基質タンパク質の同定と機能解析
Initiatorin基質候補タンパク質をTALENによりノックアウトしたカイコガ系統を作成し，これを利用して生理的な機能解析を進める。
課題②： 精子内シグナル伝達の解析
チロシンリン酸化タンパク質を同定し，リン酸化部位を明らかにする。同時に，NOが精子運動の引き金になっているので，これらのシグナル伝達系についても検討する。
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| Causes of Carryover |
Initiatorin基質タンパク質の機能同定は，研究当初から懸念されていたように，すべてが既知のタンパク質と相同性が認められなかったことから，新たにゲノム編集によるノックアウト個体の作成による解析が必要と結論した。この実験を行なうためには，新規に購入するものが多数予測されたので研究費確保の観点からも次年度使用にまわす工夫をした。また、精子成熟過程でタンパク質のリン酸化状態が変化しているタンパク質の同定を目指し，その分についても次年度使用とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
準備についてはすでに十分行えているので，ゲノム編集によるノックアウト系統の作成ならびにリン酸化タンパク質の解析に必要な昆虫飼育道具や消耗品（試薬・器具）を速やかに購入して実験を進行させる。
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