2017 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on mapping of seminal proteins and regulation of calcium and protein tyrosine phosphorylation in relation to sperm flageller waveform and capacitation in the silkworm, Bombyx mori.
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15K07793
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
長岡 純治 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 助教 (00303933)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | カイコガ / 精液タンパク質 / 精子成熟 / 精子内シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題①：in vitro，in vivoでの精子成熟時のタンパク質変化を二次元電気泳動，逆相クロマトグラフィーにより解析し，遺伝子単離，作製抗体によるWesternblottingにより6つのイニシャトリン基質候補タンパク質を見出した。しかし，これらは全てデータベースとの照合により，公知のタンパク質や機能推測が可能なタンパク質ではなかった。そこで，それぞれのタンパク質をコードする遺伝子をTALENによるゲノム編集によりノックアウトされた系統を作製し，これを用いた機能解析を目指した。現在，2系統についてホモノックアウト系統が作製でき，1系統については，ノックアウト遺伝子座が固定できた状況にある。
課題②： 精子内シグナル伝達の解析
in vitro精子成熟再現系において反応進行に伴い，Phospho-PKA Substrate抗体陽性タンパク質，精子構成するタンパク質のチロシンリン酸化の増加を見出した。チロシンリン酸化タンパク質の種類，リン酸化部位を同定するために，二次元電気泳動により当該タンパク質が分離し，PMF法により同定を試みたができなかった。しかし，N末端の配列解析からタンパク質情報が得られ，課題①の過程で，すでに明らかとなっていた生殖腺分泌タンパク質であることが判り，これが精子に強固に付着していることが判った。また，このタンパク質は精子成熟に伴い，プロテアーゼにより特異的な分解を受け，N末端側は精子から放れるが，C末端側は精子に付着している状態が維持され，この領域に存在するチロシン残基がリン酸化しているものと予測された。なお，このタンパク質についても現在，機能が予測出来ないので，ノックアウト系統を作製している。
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