2015 Fiscal Year Research-status Report
昆虫外骨格中でおきるToll経路を介した新規情報伝達
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15K07796
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
朝野 維起 首都大学東京, 理工学研究科, 助教 (40347266)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 昆虫外骨格 / 免疫シグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昆虫以外骨格はキチン及びキチン結合性タンパク質を主成分とする非細胞性マトリクスである。本研究の目的は、昆虫外骨格に存在すると考えられる新規免疫シグナル系の存在を示す事である。昆虫の主要な免疫シグナル系である、セリンプロテアーゼカスケード反応は、メラニン合成や抗菌ペプチド合成などの開始に重要である事が示されている。本研究は、昆虫の免疫シグナルを構成するセリンプロテアーゼの一つが、外骨格中のあるタンパク質成分を特異的に分解する事の意義を明らかにする事を目的とする。手法としては、主にカイコガを使った生化学的解析、及びショウジョウバエを用いた遺伝学的解析を行った。
そのセリンプロテアーゼは、通常は不活性な前駆体として存在する。バクテリアやカビの細胞壁成分などを認識する事が引き金となって開始するカスケード反応の途上で限定加水分解を経て活性化される。活性化された分子を、外骨格から抽出したタンパク質混合液に加えると、キチン結合ドメインを持つ分子量１万５千程度の分子のバンドのみが消失する事から、このタンパク質が分解されると考えられた。この際、バキュロウイルスの系で合成したプロテアーゼを用いている。このプロテアーゼは活性化の際に、特定のアミノ酸配列モチーフ部分が切断されるが、この配列をトロンビンの認識配列に置き換えたものも制作している。活性化したプロテアーゼによって外骨格成分が分解されて、どのようなペプチドが生じているのかについて、またペプチド類が血球細胞に与える影響になどについて調べた。カイコガだけではなく、ショウジョウバエでも免疫応答時に、カイコガから得られる試料中で見られた現象と同様の反応＝外骨格成分の特異的分解が生じる事を確認している。カイコガで調べられているプロテアーゼのオーソログをコードする遺伝子をノックダウンした際、分解が観察される個体の数が少ない事も確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、ショウジョウバエにおいて当該プロテアーゼのノックアウト系統を作成中である。ノックアウト個体の場合、ノックダウンよりも明瞭な表現型が観察するはずである。系統作成にはCRISPR/Cas9システムを用いるが、特に手法上の難しい部分はなく、相応の期間内での作成は可能である。
カイコガのプロテアーゼを試験管内で活性化する場合、これまで特殊な手法でカイコガ血液から得た画分中の未同定成分を用いていた。しかし今後、ショウジョウバエの体内でオーソログのプロテアーゼを異所的に発現させつつ血球細胞の動態を観察する場合、未同定の因子によるプロテアーゼ活性化は再現できない。これに対し、プロテアーゼ活性化の際に切断される配列モチーフを市販のプロテアーゼの認識配列と置き換える試みを進めている。これは、プロテアーゼの活性化とその後の外骨格タンパク質の分解を再現する際に有効な手段となり得る。
ショウジョウバエ体内でプロテアーゼ分解物を局所的に発現・分泌させた影響を観察し、vitroでの解析結果と生体を用いた観察結果を照合する。強制発現系統作成にあたり基本的にはセリンプロテアーゼによって切断され得る断片を、もらさずカバーできるようにDNAコンストラクト作りを進めている。これは、結果の取りこぼしをさけるための方針である。
「どの断片が血球細胞の免疫応答を活性化させるのか」をvitroで観察することについてはアッセイ系の条件等検討中であるが、カイコガの系だけではなく、ショウジョウバエ由来のプロテアーゼおよび同外骨格タンパク質の組み合わせで得られる断片についても調べる準備を進めている。
カイコガを用いたノックアウト系統作成については、27年度から開始予定だったが、方法の選択を含めて検討中で28年度以降本格的に進める。こちらは、主に表現型観察に用いる事を考えており、上記した研究全体の流れに大きく影響しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
プロテアーゼが活性化される際に切断されるモチーフを既知プロテアーゼの認識配列に置き換える事は、vitro、vivoの実験にかかわらず、コントロールされた実験系の構築に有効だと思われる。外骨格成分がプロテアーゼによって切断されて生じる断片は、もしかすると複数のものが同時に存在する事が重要である可能性があり、個々のペプチド断片を独立に発現させるだけでは何も観察できないかも知れない。vivoで外骨格タンパク質成分を異所的に分解できれば、少なくとも全ての断片がその位置に局在する事となり、免疫応答の発動は再現される可能性が高いと考えられる。
改変プロテアーゼを用いた副作用的な効果の可能性を検討する目的で、未改変のプロテアーゼおよび改変型プロテアーゼが外骨格タンパク質を分解する際に、同じプロセシングパターンが観察できるのかについて確認する必要がある。カイコガ・ショウジョウバエの当該プロテアーゼを合成したものを比較することが求められる。これらは研究の計画時に言及していなかった方法だが、有効な方法として進める。
血球細胞の動態についても、連携研究者からの助言等をもとにより確実な評価方の習得もしくは開発を進めながら、観察・解析を進める。また、カイコガのノックアウト系統も、同様に専門家の支援のもと進めていく。
活性のあるペプチドによって誘導されると思われる表皮細胞や血球細胞の反応を知る目的で、次世代シーケンサーもしくはオリゴアレイなどを用いた発現変動データの取得を計画の後半に開始したいと考えている。研究代表者は、非モデル昆虫を用いた次世代シーケンサーによる解析を別の研究で行う可能性があり、その経験もふまえて必要なデータが得られる方法（試料採取や有効データの選別）について検討する。
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