2015 Fiscal Year Research-status Report
RNAi法等によるシイタケ・ラッカーゼの生理的機能及び遺伝子発現メカニズムの解明
| Project/Area Number |
15K07807
|
|---|
| Research Institution | Kitami Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
佐藤 利次 北見工業大学, 工学部, 准教授 (00390881)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | シイタケ / ラッカーゼ / RNAi / 遺伝子発現メカニズム |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、食用担子菌シイタケに確認されているラッカーゼ(Lcc)に関して、RNAi法による発現抑制実験を行うことと、プラスミドタギング法により得られたLcc発現変異株の解析を行うことによって、シイタケの各Lccの機能の解明とLcc遺伝子発現制御メカニズムの解明を目的とする。
今年度は、プラスミドタギング法によって得られたLcc変異株(Lcc変異株)及びLcc1発現抑制RNAiベクター導入株(Lcc1発現抑制株)で発現しているLccに関して、RT-PCRとウエスタン解析による解析を行った。
申請者らが単離したLcc1～Lcc6、Wongらが単離したLcc7～Lcc11、Sakamotoらが確認したLcc12~14、及び森林総合研究所のシイタケゲノムデータベースで確認されているこれら以外の２種類の合計16種類のシイタケlcc遺伝子に関して、RT-PCR用のプライマーをデザインした。Lcc変異株を液体培養し、Lccが発現している時期の菌体を回収して、total RNAを抽出し、cDNA合成後、すべてのプライマーの組合せでRT-PCRを行い、どのLcc遺伝子が発現しているかを確認した。その結果、宿主株とLcc変異株ではLccの発現パターンが異なることが明らかとなった。Lcc変異株では、宿主株で発現しているLcc1遺伝子の発現が抑制傾向にあり、発現しているLcc遺伝子数が少なくなる傾向を示した。
一方、Lcc1発現抑制株を寒天培地で培養した場合には、宿主株に比べてLcc1発現抑制株のほとんどの株で、Lcc活性が早期に検出される傾向を示した。また、ウエスタン解析により、Lcc1発現抑制株では、Lcc1の発現が抑制される傾向が確認できた。さらに、これらの株の一部では、宿主株では発現していないLcc5の発現が確認された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Lcc変異株の解析に関しては、当初シイタケに存在することが報告されていた11種類のLcc遺伝子を想定していたが、その後に明らかになった情報から、シイタケに存在するLcc遺伝子が16種類であることが推定された。この情報を基に、解析する遺伝子数を増やして解析できたことから、新たな進展があった。
Lcc1発現抑制株に関しては、RT-PCRによる解析まで行うことができなかった。また、Lcc変異株のゲノムウォーキング法によるベクター導入位置の遺伝子に関する解析や、Lcc1~Lcc6に関するRNAiベクターの構築を行うことができなかった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
Lcc変異株に関しては、ベクター導入位置周辺の遺伝子解析を、ゲノムウォーキング法によって行う。また、Lcc1発現抑制株に関しては、シイタケに存在する全16種類のlcc遺伝子についてのRT-PCRによる、Lcc遺伝子の発現解析を行う。
一方、各Lcc遺伝子の発現抑制に関しては、諸性質がある程度明らかになっているLcc1~Lcc6の発現を抑制するRNAiベクターの構築を行う。また、15年度の解析結果より、Lcc1発現抑制株は、宿主株で発現されていないLcc5を発現することが明らかになったことから、lcc1とlcc5遺伝子を同時に発現抑制するためのRNAiベクターの構築を行う。これらのベクターの構築が完了次第、随時シイタケへの形質転換を行う。
|
