2016 Fiscal Year Research-status Report
RNAi法等によるシイタケ・ラッカーゼの生理的機能及び遺伝子発現メカニズムの解明
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15K07807
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| Research Institution | Kitami Institute of Technology |
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Principal Investigator |
佐藤 利次 北見工業大学, 工学部, 准教授 (00390881)
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2015-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | RNAi / シイタケ / ラッカーゼ / ウエスタン解析 / RT-PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、食用担子菌シイタケに確認されているラッカーゼ(Lcc)に関して、RNAi法による発現抑制実験を行うことと、プラスミドタギング法によって得られたLcc発現変異株の解析を行うことによって、シイタケの各Lccの機能の解明とLcc遺伝子発現制御メカニズムの解明を目的とする。
今年度は、lcc1発現抑制RNAiベクター導入株の寒天培地培養時におけるラッカーゼ活性、及びLcc1とLcc5に関するウエスタン解析を行なった。また、シイタケゲノムに確認されている16種類のlcc遺伝子の発現に関しても、RT-PCRによる解析を行なった。
ランダムに選抜した10株のlcc1発現抑制RNAiベクター導入株はすべて、ラッカーゼ活性が宿主株より7倍以上高いことが明らかとなった。また、これらのサンプルのウエスタン解析により、Lcc1の発現は、宿主株に比べると抑制される傾向を示し、強い抑制を示す株も確認できた。また、これらの株では、宿主株では発現していないLcc5の発現が、株により強弱はあるものの、ほとんどの株で確認された。
一方、RT-PCRの結果では、lcc1の発現に関しては、全く検出されない株が10株の中で1株確認された。これに対して、lcc5の発現に関しては、宿主株ではほとんど検出されなかったのに対して、10株すべてで確認された。
以上の結果から、転写レベル及び翻訳レベルで、lcc1遺伝子発現抑制RNAiベクターを導入した株では、lcc1の発現抑制が確認され、同ベクターの有効性が確認できた。また、興味深い現象として、lcc1遺伝子発現抑制RNAiベクターを導入した株では、宿主株では発現していないlcc5が新規に発現していることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
lcc1遺伝子発現抑制株の解析に関しては、lcc1の抑制と新規にlcc5が発現してくるという興味深い現象が確認されるなど、研究の進展があった。しかしながら、Lcc変異株のゲノムウォーキング法によるベクター導入位置の遺伝子に関する解析に関しては、ベクター内の配列から外側の配列に到達することができなかった。また、Lcc2~Lcc6に関するRNAiベクターの構築ができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
lcc1遺伝子発現抑制株の解析に関しては、新規にlcc5遺伝子の発現が確認されたことから、現在、lcc1とlcc5の同時発現抑制ベクターのデザインが終了しており、ベクターの構築を行なう。また、lcc2～lcc6に関する発現抑制ベクターの構築に関しても検討する。さらに、得られたlcc1発現抑制株に関しては、シイタケゲノム上に存在する16種類のlcc遺伝子に関して、リアルタイムPCR用のプライマーをデザインした上で、その発現量を宿主株と比較する実験を進める。また、Lcc変異株に関しては、ゲノムウォーキング法によるベクター導入位置周辺の遺伝子解析を進める。
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