2017 Fiscal Year Research-status Report
RNAi法等によるシイタケ・ラッカーゼの生理的機能及び遺伝子発現メカニズムの解明
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15K07807
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| Research Institution | Kitami Institute of Technology |
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Principal Investigator |
佐藤 利次 北見工業大学, 工学部, 准教授 (00390881)
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2015-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | シイタケ / ラッカーゼ / RNAi / リアルタイムPCR / リファレンス遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、食用担子菌シイタケに確認されているラッカーゼ(Lcc)の機能の解明とlcc遺伝子発現制御メカニズムの解明を目的とする。そのために、RNAi法による各lcc遺伝子の発現抑制と、Lcc発現変異株(#590株)の解析を行う。
今年度は、シイタケゲノム中に存在する全16種類のラッカーゼ遺伝子の発現をリアルタイムPCRで定量的に解析するために、その材料調製等を行なった。まず、液体培養時の各株のラッカーゼ活性の高い時期の菌体を回収した。また、シイタケに存在する16種類のlcc遺伝子の発現を検出するためのリアルタイムPCR用プライマーを設計し、12種類のlcc遺伝子の増幅を確認した。
次に、リアルタイムPCR用のリファレンス遺伝子の検討を行なった。候補遺伝子として、構成的に発現していると考えられる４種類の遺伝子を選択した。その遺伝子は、解糖系遺伝子の１つであるグリセルアルヒド－3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(以下gpd) 、電子伝達系の遺伝子の1種であるコハク酸脱水素酵素のIPサブユニット蛋白質遺伝子(以下sdc-ip)、低分子GTP結合タンパク質遺伝子の１種であるras遺伝子、及びシイタケの細胞壁成分のキチンを合成する酵素であるキチン合成酵素遺伝子（以下chs）である。宿主株と#590株の培養15日目と38日目の菌体を用いて、これらの遺伝子に関してリアルタイムPCRを行なったところ、リファレンス遺伝子として最も適しているのは、ras遺伝子、次いでchs遺伝子、gpd遺伝子となり、sdc-ipはリファレンス遺伝子としてはあまり適していないことが明らかとなった。
一方、昨年までに、lcc1遺伝子発現抑制株では、宿主株では発現していないLcc5の発現が確認された。そこで、lcc1と1cc5遺伝子の両方の遺伝子発現を抑制するための、両遺伝子の一部を連結した断片を作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
lcc1遺伝子発現抑制株の解析に関しては、リアルタイムPCR法によるシイタケゲノムに存在する全16種類の遺伝子発現パターン解析のための予備的な材料調製として、Lcc活性の高い時期の菌体回収とリアルタイムPCR用プライマーの設計とその有効性の確認など、研究の進展があった。一方、Lcc変異株のゲノムウォーキング法によるベクター導入位置の遺伝子に関する解析に関しては、配列の解析が進展し、ベクター内の配列から外側の配列までに24bpを残すところまで到達したが、シイタケゲノム配列までは到達することができなかった。また、Lcc2～Lcc6に関するRNAiベクターの構築に関しては、引き続き検討中となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
lcc1遺伝子発現抑制株の解析に関しては、リアルタイムPCR用のリファレンス遺伝子を最低３種類選択する。その３種類のリファレンス遺伝子を基準にして、シイタケゲノム中の全ラッカーゼ遺伝子16種類の発現を、lcc1遺伝子発現抑制株と宿主株を比較しながら、定量的に解析する。
また、lcc1とlcc5の同時発現抑制ベクターの構築を行なう。さらに、lcc2～lcc6に関する発現抑制ベクターの構築に関しても検討する。ベクターが作成できた後は、シイタケに導入して組換えシイタケを選抜する。
一方、Lcc変異株に関しては、ゲノムウォーキング法によるベクター導入位置周辺の遺伝子解析を進め、変異株のベクター導入位置に存在するシイタケの遺伝子を解明する。
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