2016 Fiscal Year Research-status Report
病原タンパク質の除去を目指した基質・細胞内局在改変型ユビキチンリガーゼの開発
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15K07840
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
立松 健司 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (00322743)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒田 俊一 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (60263406)
藤井 郁雄 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70189984)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 病原タンパク質 / タンパク質分解 / ユビキチンシステム / ドラッグデリバリーシステム / 一細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
任意の病原タンパク質をターゲティングするユビキチンリガーゼの基質認識部位として、Protein Aの抗体結合ドメインを骨格に持ち、一部のアミノ酸残基をランダマイズしたアフィボディ・ライブラリーを用いる。本年度は、昨年度構築したアフィボディ―ライブラリーをファージで発現させたが、ファージの独立クローン数が100 mlの大腸菌培養スケールにおいて、2万程度であった。6アミノ酸残基をランダマイズしたライブラリーとしては過小であり、スクリーニング対象として不適であった。今回用いたT7ファージライブラリーは、キャプシドg10タンパク質のC末端にアフィボディ・ライブラリーを融合して発現するものであるが、アフィボディ・ライブラリーがキャプシドの形成の影響を及ぼしていると考えられた。そこで、T7ファージで発現するアフィボディ・ライブラリーの構築を断念し、酵母表層提示ディスプレイでのリガンド・ライブラリーを発現し、全自動一細胞解析分取装置でリガンドをスクリーニングすることにした。
改変型ユビキチンリガーゼを搭載し、任意の細胞及び臓器を標的とするDDSナノキャリアとしては、前年度に作成したLG-BNCにリポソームを融合したvirosomeを作成することに成功した。リポソーム側にまず改変型ユビキチンリガーゼを封入し、LG-BNCと融合することにより標的部位への送達が可能となる。また、より実用的な送達システムを目指し、B型肝炎ウイルスの細胞膜融合能を担っていると考えられるエンベロープタンパク質のPreSドメインを提示するリポソームも作成した。今年度構築した送達システムにより、改変型ユビキチンリガーゼの部位特異的送達についてはある程度目途がついたといえる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
任意の標的タンパク質に結合するためのアフィボディについて、ライブラリーの独立クローン数が過小であったため、標的タンパク質結合リガンドを取得できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
酵母表層提示ディスプレイでのリガンド・ライブラリーを発現し、全自動一細胞解析分取装置でリガンドをスクリーニングする。具体的には、以前に作成したロイシンジッパーにより並列化されたヘリックス2本からなる構造のヘリックス・ループ・ヘリックス構造のペプチドライブラリーを酵母表層で発現させる。これに標的タンパク質が結合した場合、この標的タンパク質を蛍光抗体法で検出し、リガンド発現酵母を全自動一細胞解析分取装置で回収、リガンド遺伝子をDNAシーケンシングして、リガンド配列を同定する。
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| Causes of Carryover |
哺乳動物由来細胞を用いた改変型ユビキチンリガーゼ検証実験を計画していたが、実施できなかったため、培地の使用量が予測よりも少なかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度実施予定であった哺乳動物由来細胞を用いた改変型ユビキチンリガーゼ検証実験を次年度に実施して使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
