2016 Fiscal Year Research-status Report
迅速に進行するリン酸基転移反応の中間体ダイナミクスを可視化する分析技術の創出
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15K07887
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
木下 恵美子 広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 助教 (40379912)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | Phos-tag / リン酸基 / チオリン酸基 / ATPgS / リン酸基転移反応 / 反応中間体 / Phos-tag SDS-PAGE |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内には，ヒスチジンやアスパラギン酸のリン酸化を介した情報伝達機構がある。これは植物や細菌の細胞内で主要な機構であるが，真核生物においてもこれらの残基のリン酸化がいくつか報告されている。しかし，それらのリン酸基は，化学的に不安定で，多くは一過性の反応中間体である。そこで我々は，ATP のアナログであるATPγS を用いたチオリン酸化反応を利用し，加水分解反応を受けにくい安定な中間体を生じさせることで，これまで不明であったタンパク質リン酸基転移反応の中間体の存在を発見したり，その反応速度論を理解することをができるのではないかと考えた。本研究では申請者らが開発したフォスタグ(Phos-tag)技術を用いて，チオリン酸化反応を解析する方法を開発する。
まず，フォスタグを用いたリン酸基親和性クロマトグラフィー法を用いて，リン酸化タンパク質と同様にチオリン酸化タンパク質も分離，濃縮できるかどうかを検討している。チオリン酸化タンパク質が捕捉できることを確認したが，捕捉の効率を改善する必要がある。リン酸化タンパク質とチオリン酸化タンパク質を全て捕捉し，それ以外のタンパク質を極限まで排除するための条件の検討を行っている。
また，キナーゼやフォスファターゼの中には，基質のリン酸基を一時的に自身が受け取り，ヒスチジンやアスパラギン酸にかぎらず，リン酸化した中間体を生成するものがある。そのようなキナーゼやフォスファターゼを研究のコントロールとして，リン酸化反応中間体を安定に得ることができるかどうかを検討している。これについては，リン酸基親和性電気移動法であるPhos-tag SDS-PAGE を用いて，その反応中間体を分離，検出できるかどうかを検討する。
最終的には，種々のPhos-tag 技術を包括的に用いて，一時的で不安定な存在である酵素反応中間体の検出や解析に使える方法を開発したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
リン酸基供与体としてのATPγS は細胞に取り込まれないため，リン酸化反応はin vitro で行った。新鮮な細胞抽出液にATPγvS を加えると，含有されるリン酸化酵素によっていくつかの細胞内タンパク質はチオリン酸化されることを確かめた。それらのタンパク質が何であるかは，未知である。また，その反応後にリン酸基親和性クロマトグラフィー法であるPhos-tag agarose ビーズを用いて生成されたチオリン酸化タンパク質の捕捉を試みたところ，リン酸化タンパク質と同様に捕捉されることがわかった。検出は，溶出した試料をPNBM でエステル化してから抗チオリン酸エステル抗体を用いた。しかし，全てのチオリン酸化タンパク質が捕捉されることはなく，わずかにスルーしたものもあった。一方で，チオリン酸化あるいはリン酸化タンパク質以外のタンパク質も捕捉されていた。したがって，全てのチオリン酸化タンパク質を捕捉し，それ以外のタンパク質を極限まで排除するように条件を検討しなければならない。チオリン酸化タンパク質は，リン酸化タンパク質と非リン酸化タンパク質と比較して微量なので，捕捉したものを解析できるレベルの量にするためには，クロマトグラフィーの性能を向上させる必要がある。
また，タンパク質フォスファターゼPTP1Bは，基質のリン酸基を一時的に自身のシステインに転移させ，反応中間体を生成することが報告されているが,PTP1B のリン酸化中間体を生成させることができるかどうかを検討している。検出は，リン酸基親和性電気泳動法Phos-tag SDS-PAGE を用いる。一時的に生成するリン酸化反応中間体の検出や解析のために，種々のPhos-tag 技術を包括的に適用したいと考えて，研究を進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
チオリン酸化タンパク質をPhos-tag agarose クロマトグラフィーで捕捉できることがわかったが，分離，濃縮できるようになるまでには，クロマトグラフィーの性能を向上させる必要がある。現在は，定性的な検査にとどまっているが，クロマトグラフィーにおけるチオリン酸化タンパク質の捕捉効率など，定量的な検査を行い，確実にクロマトグラフィーの性能を向上させていく。
また，in vitro でチオリン酸化させたタンパク質のチオリン酸基が，報告されているように様々なフォスファターゼの加水分解をうけないのかどうかについても検討していく。
タンパク質フォスファターゼPTP1Bのリン酸化反応中間体の検出については，リコンビナントPTP1B を用いる予定である。PTP1B の基質としては，poly(glycine,Tyrosine)をリコンビナントチロシンキナーゼを用いてリン酸化したものを作成して用いる。PTP1B が一時的なリン酸化反応中間体を生成したかどうかは，リン酸基親和性電気泳動法Phos-tag SDS-PAGE において，リン酸化タンパク質と非リン酸化タンパク質が分離したバンドとして検出できるかどうかで判断する。
最終的には，種々のPhos-tag技術を包括的に用いて，不安定で一時的な存在であるキナーゼやフォスファターゼの反応中間体の検出や解析に役立つ方法を確立したい。
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| Causes of Carryover |
旅費やポスター印刷に予定していた予算を削減し，次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究をさらに進めるための物品，試薬購入費，学会旅費，学会ポスター印刷などに，来年度有効に使用させていただきたい。
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[Journal Article] A novel thiol-affinity micropipette tip method using zinc(II)-cyclen-attached agarose beads for enrichment of cysteine-containing molecules.2016
Author(s)
Kusamoto, H., Shiba, A., Koretake, N., Fujioka, H., Hieda, Y., Kinoshita-Kikuta, E., Kinoshita, E., koike, T
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Journal Title
Journal of chromatography B
Volume: 1031
Pages: 195-201
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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