2017 Fiscal Year Annual Research Report
Creation of the analysis technique to visualize the dynamics of labile intermediates in phosphotransfer reactions
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15K07887
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
木下 恵美子 広島大学, 医歯薬保健学研究科(薬), 助教 (40379912)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | phos-tag / リン酸化タンパク質 / チオリン酸化タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内には，ヒスチジンやアスパラギン酸のリン酸化を介した情報伝達機構がある。これは植物や細菌の細胞内で主要な機構であるが，真核生物においてもこれらの残基のリン酸化がいくつか報告されている。しかし，それらのリン酸基は，化学的に不安定で，多くは一過性の反応中間体である。そこで我々は，ATP のアナログであるATPγS を用いたチオリン酸化反応を利用し，加水分解反応を受けにくい安定な中間体を生じさせることで，これまで不明であったタンパク質リン酸基転移反応の中間体の存在を発見したり，その反応速度論を理解することをができるのではないかと考えた。本研究では申請者らが開発したフォスタグ(Phos-tag)技術を用いて，チオリン酸化反応を解析する方法を開発することを目的とする。
フォスタグを用いたリン酸基親和性クロマトグラフィー法を用いて，リン酸化タンパク質と同様にチオリン酸化タンパク質も分離，濃縮できるかどうかを検討した。チオリン酸化タンパク質が捕捉できることを確認したが，捕捉の効率を改善する必要がある。リン酸化タンパク質とチオリン酸化タンパク質を全て捕捉し，それ以外のタンパク質を極限まで排除するためには，担体へのPhos-tag担持量の増加や，クロマトグラフィー操作の条件の検討が必要である。
また，リン酸基転移反応のサンプルとして，大腸菌の情報伝達系タンパク質であるヒスチジンキナーゼ（ヒスチジンがリン酸化）とヒスチジンキナーゼからリン酸基が転移されるレスポンスレギュレータ（アスパラギン酸がリン酸化）を用いて，ATP あるいはATPγS を用いた場合のin vitroリン酸基転移反応をPhos-tag SDS-PAGEを用いて解析した。ATPγS を用いてチオリン酸化した場合は，通常迅速にアスパラギン酸に転移されるリン酸基がヒスチジンにとどまった中間体として存在する様子を可視化した。
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[Journal Article] Specific glutamic acid residues in targeted proteins induce exaggerated retardations in Phos-tag SDS-PAGE migration2017
Author(s)
Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Karata, K., Kawano, T., Nishiyama, A., Yamato, M., Koike, T.
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Journal Title
Electrophoresis
Volume: 38
Pages: 1139-1146
DOI
Peer Reviewed
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