2017 Fiscal Year Research-status Report
硫化水素シグナルの連鎖的増幅機能を有する高感度蛍光イメージングプローブの開発
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15K07894
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
奥田 健介 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (00311796)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永澤 秀子 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (90207994)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | イメージング / 蛍光 / 薬学 / シグナル伝達 / 分析科学 / 高感度化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
硫化水素(H2S)が新たなガス状の生理活性物質として近年注目を集めている。未解明の点が多く残されているもののH2Sによる様々な生理機能が明らかとなっており、さらには生細胞内のH2Sを可視化する蛍光プローブが開発され、H2Sをめぐる研究は著しい進展をみせている。
しかしながらこれらH2S蛍光プローブは、培養細胞に高濃度のH2S前駆体を投与した際の細胞内のH2Sを蛍光検出している例がほとんどであり、生理的条件下での詳細な議論が困難である。そこで本研究では、細胞内で発生したH2Sをトリガーとして自らH2Sを放出すると同時に蛍光分子を放出し、連鎖的にH2Sと蛍光を増幅して高感度に検出できるユニークなH2S増幅型センサー分子を創出することを着想し、研究を行ってきた。
前年度までに、芳香族アジドのH2S特異的な還元反応を引き金として1,6-脱離反応が進行して蛍光性化合物o-methylfluoresceinを放出することが期待されるH2S蛍光プローブをプロトタイプの第１世代蛍光プローブとして合成したが、水中でのH2Sによる蛍光応答が遅いことが明らかとなった。この遅い蛍光応答は、アジドのH2Sによる還元反応自体ではなく、引き続く1,6-脱離反応が遅いためであることが、我々による置換基効果の検討結果および関連する研究の結果より判明した。そこで今年度では、H2Sの増幅には1,6-脱離より速度的に有利な1,4-脱離反応を利用し、他のガス状生理活性物質とのクロストークを明らかにできるようなマルチカラーイメージングへの展開を見据えて様々な励起・蛍光波長（生体イメージングに有利な近赤外領域の波長も含む）を有する各種化合物の設計・合成を行ってきた。最終年度となる次年度にH2Sとの反応性を検討したうえで、生理的な細胞応答におけるH2S変動をイメージング可能か否かを検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者の異動に伴い、今年度から新規に担当した分野も含めて大幅に講義負担が増えたうえ、研究室スタッフの学内他部署への異動が重なり、学部学生実習の準備・運営に忙殺された。また、研究室の二度にわたる学内移転作業に時間を要した。その結果、それぞれしばらくの間研究が中断し、かつ研究室の立ち上げに時間を要しているために、実際に研究を進める時間が不足したことが大きな原因である。さらに、本研究で標的とする蛍光小分子プローブの設計見直しや合成ルートの変更を行うなど当初の研究計画での見積もりよりも時間を要していることも要因の一つである。現段階では、H2S特異的な反応を活用した脱離反応に基づくシグナル増幅型蛍光プローブ創製のための基礎的な知見は得られたものの、いまだH2Sシグナル増幅能を有するプローブを実証する段階には至っていないために、やや遅れていると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．シグナル増幅能を有する蛍光プローブの開発
次年度においては、本年度の時点で肉薄している第２世代のシグナル増幅能を付与したH2S蛍光プローブを完成させ、H2Sとの反応性の評価を行う。実際のシグナル増幅能の程度を評価して、結果をプローブデザインにフィードバックし、望ましい性質を有する誘導体を選抜する。次いで、in vitro培養細胞系でのH2S検出実験に適応し、プローブの妥当性を評価する。細胞透過性・毒性(WST-8 assayおよびLDH assay)などに問題が認められた場合には、適宜物理化学的なパラメータを考慮した誘導体化を行うことによってプローブの性能向上を図る。
２．細胞内小器官局在性を付与した蛍光プローブの開発
さらに、上記で選抜された化合物をもとに、細胞内小器官局在性を付与した第３世代のプローブの設計・合成を行う。導入する細胞内小器官指向性部位としては、ミトコンドリアおよびリソソーム局在性に関してそれぞれ信頼性の高い部分構造を適切に選択する。続いて、H2Sとの反応性を評価し、その結果をもプローブデザインにフィードバックさせ、望ましい性質を有する誘導体を選抜する。次いでin vitro培養細胞系に適応し、H2Sとの反応性および細胞内小器官への移行性の評価を行いプローブの妥当性を検証する。毒性あるいは細胞内移行性などに問題が認められた場合には、適宜物理化学的なパラメータを考慮した誘導体化を行うことによってプローブの性能向上を図り、分子の最適化を行う。
３．マルチカラーイメージングプローブへの展開
他のガス状生理活性物質（一酸化窒素および一酸化炭素）とのクロストークを明らかにできるようなマルチカラーイメージングへの展開を見据えて様々な励起・蛍光波長を有する各種化合物の設計・合成に取り掛かっているところであり、合成が完了次第上述の評価系にて検討し、同様に分子の最適化を行う。
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| Causes of Carryover |
「理由」
1,132,658円と繰り越しが生じた理由としては、消耗品である試薬の使用見込みと実際の使用量との間にずれが生じたためである。その原因の一つとしては、研究代表者の機関異動に伴って、今年度から新規に担当した分野も含めて大幅に講義負担が増えたうえ、研究室スタッフの学内他部署への異動が重なり、学部学生実習の準備・運営に忙殺されたことが挙げられる。また、研究室の二度にわたる学内移転作業に時間を要した。その結果、それぞれしばらくの間研究が中断し、かつ研究室の立ち上げに時間を要しているために、実際に研究を進める時間が不足したことが大きな原因であり、当初予定していたようには研究を遂行できなかった。
「使用計画」
本年度に引き続き、候補化合物の合成とH2Sイメージングの一次スクリーニング実験に関わる試薬、ガラス・プラスチック器具を必要とする。さらに次年度においては合成したプローブの二次スクリーニングならびに機能解析としてin vitro培養細胞を用いた実験系を予定しており、それぞれ培地、試薬、ガラス・プラスチック器具などの経費が必要である。さらに、細胞の機能解析を行う上で非常に有用なマルチモードマイクロプレートリーダーを合算使用により購入予定である。
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