Development of analytical method for glycoprotein-glycan interaction by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K07916
• Research Institution: National Institute of Health Sciences
• Principal Investigator: 橋井 則貴 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 室長 (20425672)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 琢雄 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 主任研究官 (10415466)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 質量分析 / 水素重水素交換 / 糖鎖 / 糖タンパク質 / 相互作用解析

Outline of Annual Research Achievements

糖タンパク質糖鎖の機能を理解するためには，糖鎖とリガンド分子の相互作用を理解することが肝要である．これまでに我々は，タンパク質の揺らぎ解析技術の一つとして知られている水素重水素交換／質量分析（HDX/MS）を用いてタンパク質間の相互作用解析をペプチドレベルで行ってきた．本研究では，HDX/MSを用いた糖タンパク質－糖鎖複合体の相互作用解析技術を検討する一環として，ATを認識する合成ヘパリン構成5糖，未分画ヘパリン（UFH）又は低分子量ヘパリン（LMWH）などのヘパリン類，ヒトアンチトロンビン（AT），並びにトロンビンの相互作用解析を行うとともに，HDX/MSの応用可能性を評価した．
まず，合成ヘパリン構成5糖とATの相互作用解析を行った結果，ATのヘパリン類の結合部位であるへリックスA（hA）及びへリックスD（hD），並びにトロンビン結合部位の露出に関連するへリックスB（hB），ストランド3A（s3A）及び近位ヒンジ領域の動的構造変化をHDX/MSにより確認できることを明らかにした．次に，HDX/MSによりトロンビン存在下及び非存在におけるヘパリン類－AT複合体の相互作用解析を行った．その結果，トロンビンの有無にかかわらず，UFHとATの複合体ではB領域のストランド構造の揺らぎが減少することが明らかとなった．加えて，トロンビン－UFH－AT複合体では，C領域のストランド構造の揺らぎの減少も観察された．尚，HDX/MS分析に用いた溶媒組成において，UFHのトロンビン阻害活性が保持されていた．
以上の結果から，トロンビン－UFH－AT複合体の形成には，B及びC領域のストランド構造の安定化が重要である可能性が示唆された．本研究によりHDX/MSは複数のタンパク質とヘパリン類等の不均一性を有する糖鎖との相互作用解析にも応用可能であることが示唆された．