2015 Fiscal Year Research-status Report
大腸癌特異的糖転移酵素の機能と転写制御の解明による新規薬剤スクリーニング系の構築
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15K07924
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
佐藤 武史 長岡技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30291131)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 癌 / 糖転移酵素 / 転写制御 / センサー細胞 / 薬剤スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
β4-ガラクトース転移酵素 (β4GalT) 4はヒト大腸癌で発現が増加し、この酵素の発現の増加は転移や予後の悪さと相関する。本研究では、大腸癌に発現する糖転移酵素に着目し、この酵素の機能と転写制御機構を明らかにする。さらに、糖転移酵素遺伝子の発現をモニターするセンサー細胞を樹立して、大腸癌に奏功する薬剤のスクリーニングシステムの構築を目指す。この酵素の機能を解析するために、β4GalT4遺伝子の発現を2倍高めた細胞をSW480ヒト大腸癌細胞から樹立した。レクチンブロット解析とTLCにより、この細胞の糖タンパク質糖鎖及び糖脂質組成を解析した結果、対照細胞と比べて糖タンパク質糖鎖は変化しなかったが、糖脂質組成は変化する傾向が見られた。次に、β4GalT4遺伝子の翻訳開始コドンから5’-上流2 kbを単離し、プロモーター活性を測定したが活性は検出されなかった。オリゴキャッピング法によって転写開始点を決定した結果、この遺伝子の転写開始点は翻訳開始コドンから5’-上流10 kb付近に複数存在した。また、ヒトβ4GalT4 mRNAには選択的スプライシングによって、構成されるエキソンが異なる2種類の5’-UTRが存在することが判明した。そこで、SW480細胞で多く使われる転写開始点を含み、転写開始点から5’-上流1.8 kbの領域を単離した。この領域にはプロモーター活性が検出され、デリーションコンストラクトを用いた解析から、この領域を5’-上流から0.5 kbまで削っても已然として高いプロモーター活性が検出された。本研究からヒト大腸癌細胞においてβ4GalT4は糖脂質の生合成に関わっていることが示唆され、この遺伝子の転写を制御する領域を0.5 kbまで絞り込むことができた。さらに、ヒトβ4GalT4遺伝子には5’-UTRが異なる2種類のmRNAが存在することが初めて明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度は、ヒト大腸癌細胞におけるβ4GalT4の機能を解析するために、SW480ヒト大腸癌細胞からβ4GalT4遺伝子の発現を増加させた細胞において、対照細胞と比べて糖脂質の組成が変化することを示した。また、ヒトβ4GalT4遺伝子の転写開始点を決定すると共に、この遺伝子の転写を制御する領域を0.5 kbまで絞り込んだ。現在、β4GalT4遺伝子の転写制御配列をルシフェラーゼ遺伝子の上流に繋いだプラスミドを作製し、大腸癌細胞への導入を行ってセンサー細胞を樹立中である。以上の研究成果から、次年度に行う実験の準備がほぼ整ったので、研究目的を、おおむね順調に達成できたと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
樹立したβ4GalT4遺伝子の発現を増加した細胞を用いて、癌悪性形質を解析する。β4GlaT4遺伝子のプロモーター領域に結合する転写因子を、ゲルシフトアッセイ等により同定する。β4GalT4遺伝子の転写制御配列を含むレポータープラスミドを導入した大腸癌細胞を用いて、ルシフェラーゼ活性を指標とする薬剤スクリーニングシステムを構築する。さらに、他のβ4GalT遺伝子の発現を抑制する薬剤を用いて、構築したシステムにおける細胞の応答性を評価する。
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| Causes of Carryover |
実験の効率化を図ったことにより、当初使用を予定していた研究費を一部使用することなく、平成27年度の研究実施計画をおおむね達成できた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
幾つかの研究実施計画に関して、さらに詳細に解析する必要があるのと、平成27年度から継続している研究実施計画があるため、翌年度以降に請求する研究費と合わせて使用する。
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