2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K07932
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
黒田 照夫 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80304327)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バンコマイシン / VRE / ペプチドグリカン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Compound Kとバンコマイシンの併用メカニズムを明らかにするために以下の研究を進めた。
最初にバンコマイシン耐性に関わる遺伝子群の発現解析を行った。バンコマイシンは細胞壁ペプチドグリカンの生合成過程や架橋反応を阻害する。このバンコマイシン耐性は、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)が保有する薬剤耐性プラスミド上に存在するVanA遺伝子群またはVanB遺伝子群によりもたらされる。感受性腸球菌（VSE）では併用効果は見られないことからこれら遺伝子群の発現あるいは種々の酵素の機能を抑制することによって、併用効果が発現していると考えられる。そこで、これら遺伝子群の発現をRT-PCR法により確認した。その結果、発現は減少しておらず、発現量減少による感受性化ではないことが分かった。またペプチドグリカンの組成解析を進めるべく、LC-MSにおける内部標準となる化合物(DAla-DLac)の化学合成を行った。しかし共同機器であるLC-MSの修理が必要となり、この実験は後回しにした。その代替として、バンコマイシンの蛍光標識体を用い、ペプチドグリカンのペプチド末端のDAla-DAlaの存在量を、蛍光顕微鏡を用いて評価することとした。バンコマイシンが結合できるDAla-DAlaの量が多ければ、菌はバンコマイシンに感受性を示すからである。濃度検討などを行い、評価をする準備が整った段階である。これらの実験から、VanA遺伝子群に含まれるいくつかの酵素の活性が阻害されている可能性が高くなった。そこで、DAla-DAlaをDAla-DLacに置換するために必要なVanA遺伝子群に含まれる複数の酵素について、大腸菌を用いて大量発現し、タンパク質精製を行って、その活性を測定することとした。現在、大量発現プラスミドを構築中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度計画していたバンコマイシンとの併用効果のメカニズムについては、一定の進展が見られた。LC-MSが使用不可能となるなど不測の事態も起こったが、蛍光顕微鏡を用いた解析や、28年度に予定していたタンパク質の精製に向けた実験を行うことができた。論文も受理されたことから、予想以上に進んでいると判断される。
一方で、アミノグリコシド系抗菌薬との併用効果の方は、バンコマイシンの作用機序の解析に時間をかけたため、あまり進んでいない。また実験代表者の異動に伴い、27年度末は研究をあまり進められなかった。
よって総合的に見て「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは異動に伴う研究の遅れを取り戻す必要がある。病原体の使用や組換えDNA実験の承認を迅速に得て、実験の体制を整える。また共同機器の使用についても状況を調査し、使用可能となるよう手続きを早く終わらせる。
一方で、タンパク質の精製に向けた実験は当初計画よりも進んでいることから、こちらを先に進める。また放射性同位元素使用の手続きも速やかに行い、アミノグリコシドとの併用効果についても解析を進める。
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| Causes of Carryover |
LC-MSの使用不能に伴って、当初予定していた使用料金を支払う必要がなかったこと、および研究代表者の異動が決定し、その準備のため、27年度末の2か月ほど研究を進めることができなかったことが大きな理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
LC-MSが使用できない間、そのほかの実験は進めていた。異動先で準備が整い次第、すべての実験を同時進行で行う予定である。
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[Journal Article] Action mechanism of 6, 6'-dihydroxythiobinupharidine from Nuphar japonicum, which showed anti-MRSA and anti-VRE activities.2015
Author(s)
Okamura S, Nishiyama E, Yamazaki T, Otsuka N, Taniguchi S, Ogawa W, Hatano T, Tsuchiya T, Kuroda T.
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Journal Title
Biochim Biophys Acta. (General Subjects)
Volume: 1850
Pages: 1245-1252
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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