2015 Fiscal Year Research-status Report
プロトンポンプによるイオン環境の形成とオルガネラ輸送の新展開
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15K07939
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
中西 真弓 岩手医科大学, 薬学部, 教授 (20270506)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 液胞型プロトンポンプ / V-ATPase / 破骨細胞 / 小胞輸送 / 酸性環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、V-ATPaseのa3イソフォームの欠損マウスを解析し、リソソームに局在するa3が、分泌リソソームの細胞膜への移動に必須であることを見出した。さらに、このa3と特異的に相互作用する小胞輸送因子を同定した。また、この因子の活性型あるいは不活性型を強制発現させた前駆細胞を分化させ、分泌リソソームの移動には活性型である必要性を示唆した。
平成27度は、以上の結果を確認する実験を行った。まず、小胞輸送因子の活性状態が分化に影響している可能性を排除するため、破骨細胞に分化させてから活性型と不活性型を強制発現させた。その結果、活性型でのみリソソームの移動が見られ、分化状態に関わらず、活性型である必要性を確認した。一方、コレステロールの局在変化により、分泌が抑制されることが報告された。そこで、野生型とa3を欠損した破骨細胞で局在を比較したところ、違いは認められなかった。a3の欠損によるリソソーム分泌の低下は、コレステロールの局在変化による二次的な影響でないことを確認した。
同定した小胞輸送因子は、a3イソフォームとは結合するが、a1、a2とは殆ど結合しない。そこで、各オルガネラに特異的なaイソフォームが輸送因子を選別してリクルートしている可能性を考え、輸送因子ファミリーとaイソフォームとの結合の網羅的解析に着手した。その結果、a3は、リソソーム輸送に関連する輸送因子群とは結合するが、リサイクリングエンドソームの因子とは結合が弱いことがわかった。これは、aイソフォームによる小胞輸送の方向決定機構の解明につながる重要な知見である。
さらに、破骨細胞の形成を阻害する化合物を検索する目的で、マーカー酵素の活性を測定するスクリーニング系の構築を試みた。既に阻害活性が報告されているクルクミン存在下で、分化が抑制される実験系が構築できたが、誤差が大きいためさらなる条件検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要で述べたように、V-ATPaseの小胞輸送における機能の解析については、順調に成果をあげている。一方で、V-ATPaseの構造の違いによる触媒機構の差異の解析はやや遅れているため、概ね順調とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
V-ATPaseの小胞輸送における機能については、平成２７年度と同様に、aイソフォームと小胞輸送因子ファミリーとの結合の網羅的解析を中心に進める。同時に、酸性環境やdイソフォームの存在が、結合や因子の活性化に与える影響を検討し、活性化機構の解明に迫る。
また、a3イソフォームの遺伝子を欠損した破骨細胞にa3を強制的に発現させると、骨吸収活性が回復した。この実験系を用いて、大理石病患者で同定された変異a3の機能を解析し、発症のメカニズムを明らかにしたい。
一方、骨吸収活性の制御を目指して、破骨細胞への分化を抑制する化合物の検索を継続する。平成27年度に引き続き、マーカー酵素の活性測定のスクリーニング系を改善する。それが困難であれば、ウエスタンブロットなどによるマーカー酵素の検出で検索することを検討する。
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Research Products
(7 results)
