2016 Fiscal Year Research-status Report
DNA複製開始制御の破綻に伴うゲノム構造不安定化と、その防御機構に関する研究
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15K07948
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
多田 周右 東邦大学, 薬学部, 教授 (00216970)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | Cdt1 / gemnin / RecQ4 / DNA複製 / DNA鎖伸長反応 / ゲノム安定性維持機構 / 非相同末端結合修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画では、DNA複製開始に重要な役割を果たすことが知られるCdt1、Cdc6、RecQ4の3つのタンパク質に焦点を絞り、これらが細胞内の遺伝情報安定性維持機構とどのような連携を果たし影響を与えているのかについて検討することを目的としている。これまでの解析から、Cdt1がDNA複製フォークの進行を妨げることで、新生鎖伸長反応を阻害する可能性を提示し、この作用に重要なCdt1の分子内領域を示した。平成２８年度は、前年度までの知見をもとに設計された様々な形態のCdt1、あるいはCdt1の阻害タンパク質であることが知られるgemininを、ヒトHEK293細胞やニワトリDT40細胞を親株として細胞内に発現誘導し、ゲノム構造の異常を細胞内で解析するための準備をおこなった。一部の細胞は樹立され、フローサイトメトリーを用いた基礎的検討の中で、Cdt1の発現誘導に伴うゲノム構造の異常を示唆する結果が得られつつある。
また、RecQ4については、DT40細胞を用いた解析から細胞の生存に抑制的な影響を与えることが示されているRecQ4のN末側領域について、アフリカツメガエル卵抽出液を用いた検討を行ってきた。前年度までの結果より、RecQ4のN末端領域がDNA末端の融合に何らかの抑制的作用を示すことが示唆されているが、平成２８年度は定量的PCR法などを利用してより詳細な解析が可能となる手技や条件を整えた。この手技・条件のもとで、DNA依存性タンパク質リン酸化酵素阻害剤やDNAリガーゼⅣ阻害剤を用いた実験をおこない、RecQL4のN末端領域が阻害しているDNA末端融合活性は非相同末端結合の働きによるものである、という予想を補強する実験結果を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２７年度には、Cdt1がDNA複製時の新生鎖伸長反応を抑制するときのメカニズムとして、DNA複製フォークの進行を抑えている可能性を提示するとともに、その働きに要求されるCdt1の構造を明確にすることを目指してきた。これらの検討は、細胞内でCdt1による同様の影響が生じたときに細胞がどのように応答するのかを解析するための基礎的な知見を得る目的もあり、この知見をもとにCdt1やCdt1阻害タンパク質gemininの変異体タンパク質を設計し、細胞レベルの解析に供する予定である。このために、平成２８年度には前年度までの研究成果の補完と再現性の確認に取り組んだだけでなく、各種Cdt1あるいはgemininの変異タンパク質を設計して発現誘導可能な培養細胞株を樹立するに至っており、今後の細胞レベルの解析に向けて順調に進行していると考える。
また、RecQ4に関する解析についても、前年度に見出されたRecQ4のN末端領域がDNA末端融合を抑制する可能性について検討を継続し、より詳細な解析が可能な実験系を準備するまでに至っている。また、同時に相同組換えによるDNA二本鎖切断修復の生化学的評価系の樹立も目指しており、今後の解析結果の蓄積が大いに期待できると考えている。すなわち、最終年度における本研究の取りまとめに向けて、実験計画はおおむね順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、研究計画の最終年度の取り纏めに向け、これまでの実験を補完し完成度の高い実験結果に仕上げる。また、Cdt1の発現誘導が可能な細胞株の樹立に成功したことから、同様の方法で様々なCdt1変異体の発現を試み、外来遺伝子を含まない細胞の挙動や野生型タンパク質を発現させた細胞の挙動と比較して、種々の生化学的活性が持つ細胞内での役割を検討していく予定である。とくに、DT40細胞で発現誘導を行うことにより、種々のゲノム安定性維持機構に欠損のある細胞株を解析に用いることが可能となり、Cdt1の過剰発現によるゲノム不安定化とこれに対する細胞内の応答の関係や、DNA再複製による遺伝子増幅の定着に影響を与えるDNA修復過程の同定が期待できる。 RecQ4についてはN末端領域を中心に、DNA二本鎖切断修復への寄与を生化学的に明らかにすることを目標とする。またほかにも、RecQ4の欠失変異体や点変異体を多数作出して同様の解析に用いるなど、機能領域の連携について知見を得ることを目指した研究も開始する。同時に、培養細胞より遺伝子破壊株や変異体タンパク質発現誘導株を作出し、これまでに明らかになった生化学的挙動を細胞内で再現するとともに、その生理的意義を探ることを目標に、さらに発展的な研究を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
前年度及び当該年度前半に行った実験や研究は、既存の研究装置や研究環境を利用し、今後に向けての条件検討や解析手段に関する基礎的な検討、あるいは今後の研究のための材料の確保を中心に実施してきた。また、試薬、器具なども前年度に購入したものを利用したり、一度購入したものを繰り返し利用したりするなど、効率的に利用できる場面が多かった。当該年度の後半からはある程度の準備も整い、実際の解析、検討に向けた研究が開始されたが、当該年度全体で実際に使用した経費は申請した額には至らなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、本研究計画の最終年度に当たるため、これまでの研究成果を様々な視点から捉え直すような実験が必要とされる。このため、解析手段も多岐に及ぶことが予想され、これまでのような、実験試薬や実験器具などの効率的な利用は望めない可能性が高い。また、ひとつの解析結果に応じて、種々の側面から細かく条件を変動させながら、新たな解析、検討を繰り返す必要があるため、能率的な実験の遂行のためにも比較的高額な実験器具や試薬を利用して無駄なく研究を遂行する必要があると考えている。したがって、当該年度に未使用となって繰り越された研究経費は、次年度に使用する予定である。
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