2016 Fiscal Year Research-status Report
死細胞により誘発される炎症応答が老化に伴って悪化する仕組みの解明
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15K07949
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
永田 喜三郎 東邦大学, 理学部, 准教授 (10291155)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 芳郎 東邦大学, 理学部, 教授 (10134610) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 老化 / アポトーシス / 炎症 / マクロファージ / 貪食 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
老化に伴うアポトーシス細胞に対するマクロファージ貪食能の低下がマクロファージ自体の細胞老化に起因するのか、または老化に伴う個体環境の変化（個体老化）に起因するのか調べるため、老化マクロファージの若年マウスへの移植実験の条件検討を行った。本実験では、レピシエントとして腹腔内マクロファージを枯渇処理した若年マウスを、ドナーとして用いる老化マクロファージとして骨髄細胞から誘導した長期培養マクロファージを用いる。
マクロファージの枯渇は、細胞毒であるクロドロネートのリポソームを作製し、それを選択的に取り込むマクロファージにアポトーシスを誘発されることにより行った。クロドロネート・リポソームをマウス腹腔内に投与して２日後には、腹腔内のマクロファージは完全に消失し、そのまま７日目まで回復することはなかった。この結果から、安定して腹腔内マクロファージが枯渇されているクロドロネート・リポソーム投与後４日目の若年マウスをレピシエントとすることとした。
一方、骨髄細胞からGM-CSF含有培地で３ヶ月間誘導したマクロファージの調整に成功した。このマクロファージは、マクロファージに特異的な細胞表面抗原（F4/80）を持ち、またアポトーシス細胞を常在性マクロファージと同等に有していることが分かった。この結果から、この３ヶ月間長期培養マクロファージをドナー細胞として用いることとした。
さらに、アポトーシス細胞除去に伴う炎症応答の終息期に浸潤してくる好酸球の細胞数が老化に伴って有意に低下していることを明らかにした。この結果は、好酸球が炎症応答の終息に積極的に関わっていることを示すとともに、老化に伴う好酸球浸潤の低下が老化における炎症応答の持続悪化の原因の可能性であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画していたマクロファージ移植実験の条件検討は、ほぼ完了している。また慢性化の実験に関しては、老化に伴って炎症の終息に関わる好酸球の役割についての成果も着実に重ねてきている。これらを総合的に判断して、全体的に概ね順調とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
常在性マクロファージによる貪食応答低下のメカニズムの解明：貪食されたアポトーシス細胞の消化・分解への老化の影響：先に述べたように貪食されたアポトーシス細胞がマクロファージ細胞内で速やかに消化・分解されることが、継続的なアポトーシス細胞の貪食除去に重要である。そこで老化マウスおよび若年マウスから調整した腹腔内マクロファージにアポトーシス細胞を貪食させたとき、①アポトーシス細胞の細胞内消化・分解の経時変化②継続的な貪食応答について解析し、老化マウスにおけるマクロファージの貪食応答の低下がアポトーシス細胞の消化・分解に起因するか否かを検証する。
炎症応答の重篤化・慢性化への老化の影響：ネクローシス好中球から放出されるS100の解析：炎症巣に集積する好中球の動態についてはあまり分かっていないが、炎症巣に多量の好中球が動員されると、アポトーシスを経てネクローシスに陥ると考えられる。また、好中球の細胞内にもS100というDAMPsが存在する。ネクローシスした浸潤好中球からS100が放出されると、二次的な好中球の浸潤を促し、炎症応答が連鎖的に引き起こされ、結果として慢性化すると考えられる。そこでまず、S100の生化学的解析を行うためのツールとしてS100（特に好中球に強く発現しているCalprotectin; S100 A8/A9）に対する抗体の取得を行う。（抗体取得後）老化がS100の産生および機能に影響を及ぼす可能性があるので、③炎症終息期におけるS100産生量への影響④S100中和による炎症応答の慢性化への影響について調べ、二次的に産生されるS100の機能に対する老化の影響について明確化し、前項から得られる知見と合わせて老化における炎症反応の慢性化のメカニズムに迫る。
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| Causes of Carryover |
長期培養マクロファージが老化細胞であることの検証を行うために予定していた老化マーカーであるSA beta-galおよびp16の発現を免疫生化学的に解析する試薬を購入しなかったため、本計画を次年度計画している。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
マウス骨髄細胞から樹立した長期培養マクロファージを移植実験に用いる前に樹立されたマクロファージが老化細胞として定義して良いか、老化マーカーであるSA beta-galの細胞内染色を行う。また遺伝子レベルでも細胞老化の確証を得るため、p16の発現を遺伝子レベルおよび蛋白レベルでの検出を行う。これらの結果を経て、老化マクロファージの移植実験を行い、老化に伴うマクロファージ貪食能低下のメカニズムを明らかにする。
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