2016 Fiscal Year Research-status Report
癌および炎症疾患における新規ヒアルロニダーゼの機能と発現調節機構の解明
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15K07951
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
山田 修平 名城大学, 薬学部, 教授 (70240017)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ヒアルロニダーゼ / コンドロイチン硫酸 / ヒアルロン酸 / 癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒアルロニダーゼ（HYAL）ファミリーの1つである、新規酵素ヒアルロニダーゼ４（HYAL4）の、癌および炎症における役割を解明しようとしている。HYAL4はヒアルロン酸（HA）によく似たグリコサミノグリカンであるコンドロイチン硫酸（CS）に特異的に作用する酵素であり、癌の発症に関係する可能性がある。今年度は以下の研究を行った。【１】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすHYAL4の効果： HEK293細胞に、HYAL4の遺伝子を安定導入し、高発現細胞株を作成した。HYAL4を高発現している細胞株に対して、shRNAを安定導入した。mRNAの発現量を定量し、ノックダウンが起こっていることを確認した。培地中のCS量の変化も定量したが、コントロール細胞に比べ、変化は見られなかった。【２】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすCSオリゴ糖の効果：精巣型HYALを用いて市販のHA、CS-A、CS-Cを消化した。消化物をゲルろ過HPLCで分画し、四糖、六糖、八糖を大量に得た。【３】HYAL4ノックアウトマウスの作製：次年度以降の実験のために、HYAL4ノックアウトマウスの作製を継続的に行った。現在、ES細胞への導入を行っている。【４】ヒトの癌組織や炎症組織でのHYAL4の発現：様々な癌組織におけるHYAL4の発現亢進を、リアルタイムPCRで調べた。発現亢進している癌組織もあったが、同じ種類の癌組織でも発現していない場合もあり、統一した見解が得られていない。更なる解析が必要である。【５】HYAL4の機能解明の一環として、細胞内局在を免疫蛍光染色によって調べた。基質特異性に関与する可能性の高いアミノ酸に変異を導入し、基質認識のメカニズムの解明を行った。特に中枢神経系での機能解明に注目し、発生段階の異なる脳や脳の異なる部位での発現の変化について、リアルタイムRT-PCRで解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【１】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすHYAL4の効果、【２】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすCSオリゴ糖の効果、【３】HYAL4ノックアウトマウスの作製、【４】ヒトの癌組織や炎症組織でのHYAL4の発現、【５】HYAL4に特異的な阻害剤の開発、の５項目を予定していた。
【１】、【２】、【４】、【５】については、ほぼ予定取り進行しているものの、【４】、【５】についてはネガティブな結果しか得られていない。【３】は少し遅れている。そのため、新たに、HYAL4の細胞内局在の解析、HYAL4の基質特異性に関与するアミノ酸の解析を介した基質認識のメカイズムの解明を行って、成果が上がっている。よって、全体としては、バランスがとれ、おおむね順調であるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
【１】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすHYAL4の効果、【２】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすCSオリゴ糖の効果、【３】HYAL4ノックアウトマウスの作製、【４】ヒトの癌組織や炎症組織でのHYAL4の発現、【５】HYAL4に特異的な阻害剤の開発、の５項目を予定していた。
【１】、【２】については、順調に進んでいるので、特に力を入れて進めていきたい。【３】は少し遅れているが、CRISPR/CAS9を利用したノックアウトマウスの作製も同時進行させており、なんとか最終年度中にマウスの作製と基本的な観察だけは終えたい。【４】については、癌アレイや癌組織の新しい提供元を模索する。もし、新しい試料が入手できない場合でも、【１】や【２】の実験で代用できると考えている。【５】については、共同研究者であるインド バンガロール大学のBasappa博士からの化合物の供給がないので、他の化合物ライブラリーを利用することを検討している。また、そのために、活性測定法の簡略化も検討している。
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| Causes of Carryover |
ほぼ予定通りに使用したが、若干の端数が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の消耗品費に組み込み、使用する
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[Journal Article] Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 (CSGalNAcT-1) deficiency results in a mild skeletal dysplasia and joint laxity.2017
Author(s)
Julia Vodopiutz, Shuji Mizumoto, Ekkehard Lausch, Antonio Rossi, Sheila Unger, Nikolaus Janocha, Rainer Seidl, Susanne Greber-Platzer, Shuhei Yamada, Thomas Muller, Bernd Jilma, Rudolf Ganger, Andrea Superti-Furga, Shiro Ikegawa, Kazuyuki Sugahara, Andreas R. Janecke.
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Journal Title
Human Mutation
Volume: 38
Pages: 34-38
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Functional validation of novel compound heterozygous variants in B3GAT3 resulting in severe osteopenia and fractures: expanding the disease phenotype.2016
Author(s)
*Florian Job, *Shuji Mizumoto, Laurie Smith, Natario Couser, Ashley Brazil, Howard Saal, Melanie Patterson, Margaret I. Gibson, Sarah Soden, Neil Miller, Isabelle Thiffault, Carol Saunders, Shuhei Yamada, Katrin Hoffmann, Kazuyuki Sugahara, Emily Farrow. (*equal contribution)
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Journal Title
BMC Medical Genetics
Volume: 17
Pages: 86
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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