2016 Fiscal Year Research-status Report
mTOR・Mnkプロテインキナーゼ系による翻訳調節を介した細胞増殖制御機構の解明
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15K07953
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| Research Institution | Osaka University of Pharmaceutical Sciences |
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Principal Investigator |
福永 理己郎 大阪薬科大学, 薬学部, 教授(移行) (40189965)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / プロテインキナーゼ / 細胞増殖 / 翻訳制御 / MAPキナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H27年度の研究で作成したMnk1発現MEF細胞と親株のMnk-DKO MEF細胞について，二次元差分電気泳動（2D-DIGE）によるプロテオーム解析を行った結果，Mnk1の発現条件下でタンパク質レベルが低下する候補タンパク質としてKRIT1（Krev-interaction trapped 1）を同定した。KRIT1はRas-MAPキナーゼ経路への関与が示唆されており，KRIT1 mRNAの翻訳効率がMnk1によって制御される可能性について検討している。
また，Mnk1あるいはMnk2のノックアウトマウス（Mnk1-KO, Mnk2-KO）から樹立した胚性線維芽細胞(MEF)を用いて血清飢餓後の増殖因子刺激によるMnk活性化動態を検討した結果，Mnk2-KO細胞では増殖刺激によってeIF4Eのリン酸化が速やかに誘導されるのに対し，Mnk1-KO細胞ではeIF4Eリン酸化が逆に低下することを見出した。すなわち，Mnk1が存在しない条件下では，増殖刺激によってMnk2の不活化とeIF4Eの脱リン酸化が促進されることが示された。
他方，CRISPR/Cas9システムを利用してヒトHeLa細胞のMnk1遺伝子ノックアウトを試みた。pX330プラスミドを用いてヒトMnk1遺伝子の２ヶ所を標的とする発現ベクターを作成してピューロマイシン耐性遺伝子との共トランスフェクションを行い，一過的に薬剤耐性となったHeLa細胞集団を選択した。この細胞集団では内在性Mnk1の発現が検出限界以下に低下しており，HeLa細胞では迅速・簡便に遺伝子ノックアウトができることが分かった。このMnk1-KO HeLa細胞では，マウスMnk1-KO MEF細胞と同様，血清による増殖刺激によってeIF4Eのリン酸化が低下することを見出し，Mnk2活性制御の普遍性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
『研究実績の概要』で記したように，Mnk1/2の活性制御機構の研究計画についてはおおむね順調に進展した。CRISPR/Cas9システムを用いた一過性薬剤選択法によってHeLa細胞で迅速・簡便に遺伝子ノックアウトを行えることが判明したので，当初に計画していたmiR30模倣RNA発現系による種々のヒトがん細胞のMnk1ノックダウン研究については， CRISPR/Cas9法によるMnk遺伝子ノックアウトに変更することにした。また，2D-DIGEによるMnk1標的タンパク質のプロテオーム解析についても，候補分子KRIT1を同定し，その解析に着手することができた。しかし，eIF4Eのリン酸化によるトランスレイトーム変動を解析する計画については，mRNAと翻訳開始複合体を免疫沈降する条件設定が期待通り進まなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
『研究実績の概要』で記した成果を踏まえ，それらをさらに発展させた研究をH29年度の計画に沿って実施していく予定である。特に，Mnkの活性化動態については，チロシンキナーゼシグナル伝達経路の活性化に応答してMnk2の不活性化とeIF4Eの脱リン酸化が促進される現象が，マウスMEF細胞だけでなくヒトHeLa細胞でも確認されたことから，様々なヒト由来がん細胞についてMnk1/2のノックアウトを行って，その活性化動体を解析する意義が高まった。また，『進捗状況』で記したように，トランスレイトーム解析のためのeIF4E免疫沈降の条件設定が遅れていることから，新たに種々の抗eIF4E抗体を試みると共に，翻訳開始複合体とmRNAをクロスリンクする方法について重点的に検討することにした。また，Mnk1標的タンパク質のプロテオーム解析については，KRIT1の解析に加えて他の候補タンパク質についても質量分析による同定を試みる計画である。
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