2015 Fiscal Year Research-status Report
カイニン酸誘発てんかんモデルにおけるPGE2受容体の役割
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15K07970
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
松尾 由理 北里大学, 薬学部, 講師 (10306657)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 癲癇 / プロスタグランジンE2 / EP3受容体 / カイニン酸 / 炎症 / 痙攣 / 不安 / ノックアウトマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに、脳虚血モデルにおいてPGE2がEP3受容体を介して、グルタミン酸による興奮毒性を促進し、脳梗塞障害を悪化させることを明らかにしている。本研究では、同じく興奮毒性が知られる、カイニン酸誘発癲癇モデルにて、EP3受容体の関与を検討した。はじめに、マウス腹腔内にカイニン酸を投与し、PGE2が産生されるかを調べたところ、投与１日後に海馬において顕著なPGE2の産生増加が認められた。その機序を調べるために、PGE2合成に関わる酵素のmRNAをReal-time PCR法にて検討したところ、誘導型酵素であるCOX-2とmPGES-1のmRNAの顕著な発現誘導が認められた。そこで次に、EP受容体の発現を検討したところ、EP1~4受容体すべての発現増加が認められ、特にEP2、3、4受容体の発現は有意に増加した。そこで、顕著な発現増加が認められたEP3受容体の発現細胞の同定を試みたが、抗体の特異性が低く、同定には至らなかった。痙攣誘発後のEP3受容体の関与が示唆されたため、カイニン酸投与2時間の痙攣行動を、野生型とEP3欠損型マウスで比較したところ、欠損型で有意に痙攣が弱かった。Open field試験において、野生型マウスでは中央滞在時間が痙攣群では延長しており、不安異常が認められたが、EP3欠損型マウスでは、正常と同程度であり、有意に症状が弱かった。空間学習行動についても、Y迷路や新規物体、新規位置認識試験を行ったところ、野生型で痙攣誘発後に記憶学習の低下傾向が認められ、欠損型で改善傾向が認められたが、有意なものではなかった。以上より、側頭葉癲癇後に海馬にてEP3受容体が発現増加し痙攣を悪化させること、さらに痙攣後の不安異常に関与することが示唆された。従って、EP3受容体の役割がさらに明らかになれば、側頭葉癲癇治療の新たなターゲットになるものと期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
カイニン酸投与癲癇モデルにおいて、海馬でのPGE2の産生増加とEP3受容体の発現増加が認められたため、海馬における神経興奮と痙攣、さらには神経細胞死に、EP3受容体が関与する可能性が強く示唆された。実際に、EP3欠損型マウスでは、野生型マウスに比べ、痙攣が軽度であったことからも、EP3受容体の重要性が伺える。行動実験においても、不安に関しては、野生型でみられる不安異常が、EP3欠損型では見られないという興味深い結果が得られている。空間学習に関しては、野生型で痙攣後に記憶が障害されることが予想されたが、有意な結果にはならなかった。これは、痙攣の強さが、動物個体によってばらつくため、遺伝子型間の違いが評価できなかったものと考えられる。痙攣の強さをある程度一定化できるような方法へと改善する、或いは、例数を上げることで、小さな差異も評価できるものと思われる。EP3受容体発現については、免疫染色が曖昧であり、新しく抗体を入手して検討を行ったが良好な結果が得られなかった。今後、神経細胞やグリア細胞を単離培養することで、どの細胞のEP3受容体が重要であるかが分かるものと考えており、現在、海馬神経細胞の初代培養系での検討も始めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
In vivoの解析においては、さらにEP3受容体の役割について、海馬神経細胞死やグリア細胞の活性化について検討を行う。即ち、野生型マウスとEP3欠損型マウスにおいて、カイニン酸投与1～3日後の海馬における神経細胞とグリア細胞をそれぞれ染色することで、神経生存やグリア活性化について評価する。さらに、IL-1βやTNF-αなどの炎症性サイトカインの産生についても、両遺伝子型間で比較検討する。不安行動や学習行動については、ある程度痙攣強度が安定するよう、癲癇重積に至るまでカイニン酸を追加投与することで、痙攣行動のばらつきを抑えた状態にて、野生型マウスとEP3受容体欠損型マウスでの、不安行動、空間学習行動の違いを評価する。
In vitroの解析においては、マウス胎児脳より海馬及び大脳皮質の神経細胞を単離培養し、カイニン酸による神経毒性における、EP3受容体の役割について、EP3受容体アゴニスト、アンタゴニストを用いて検討する。また、マウス新生児脳よりグリア細胞を単離培養し、カイニン酸投与によるグリア細胞の活性化とEP3受容体の役割について、薬理学的に解析を行う。これらの結果を踏まえ、神経-グリア共培養系における、神経細胞死とEP3受容体の関係を詳細に解析する。
本計画より、側頭葉癲癇における痙攣行動と神経細胞死におけるEP3受容体の役割が明らかになるものと確信している。
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| Causes of Carryover |
EP受容体の抗体を幾つか購入したが、抗体の特異性が弱く、免疫染色での検討には不適であった。このため、現在、免疫染色可能な抗体を、ロット番号も含めて、使用実績を慎重に調べており、購入抗体の選定のため使用が遅れた。さらに、北里大学から北陸大学への研究代表者の異動があり、一時的に研究が止まり、機器の購入も遅れたため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本研究では自家繁殖したEP3受容体欠損型マウスとその野生型マウスの維持のための床敷きや餌の費用、新たに購入するマウス、ラット等の費用が必要である。また、EP受容体の発現細胞同定のための、免疫染色可能な抗体を購入する。グリア活性化を免疫染色にて検討するためにも、各種抗体の購入が必要である。グリアマーカーやサイトカイン等のmRNA発現解析のため、primer、mRNA抽出、cDNA作成、qPCRのためのキットを要する。PGE2量、サイトカイン量の測定には、EIAキットを購入する。In vitro培養実験では、動物の他、各種培養関連器具と試薬の購入を要する。さらに、各種生化学的、分子生物学的、薬理学的試薬の購入を予定している。
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