心臓におけるTRPM2チャネルの局在とその役割

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07978
• Research Institution: Teikyo Heisei University
• Principal Investigator: 清水 俊一 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (60196516)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 戸田 雄大 横浜薬科大学, 薬学部, 講師 (30573852) ; 根来 孝治 昭和大学, 薬学部, 講師 (70218270)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 心臓 / TRPM2 / ADP-ribose / 活性酸素 / マウス / 心臓機能

Outline of Annual Research Achievements

TRPM2は細胞の形質膜に存在し、酸化ストレスにより活性化され細胞内にCa2+を輸送する陽イオンチャネルである。心臓において、低レベルのTRPM2 mRNA発現が認められるが、その役割は明らかとなっていない。そこで、我々は心臓内においてTRPM2 が局在している可能性を考え、心臓を右心房、左心房、右心室及び左心室に分画し、TRPM2 mRNA発現をRT-PCR法により測定した。その結果、左心房、右心室及び左心室に比べて右心房にTRPM2 mRNAの高い発現が認められた。さらに、心臓の切片を作製し、in situハブリダイゼーション法によりTRPM2の局在を調べたところ、右心房、特に大静脈洞近傍にTRPM2の局在を認めた。TRPM2が発現している細胞では、細胞内にADP-riboseを導入するとTRPM2のC末端側に存在するNudixモチーフに作用してTRPM2チャネルが活性化される。そこで、心臓の各部位より心筋細胞を分離し、TRPM2の機能的発現を電気生理学的手法により検討した。その結果、TRPM2 mRNA 発現と一致して、野生型マウスの大静脈洞近傍から単離した細胞では、ADP-riboseを導入すると内向き電流が認められた。一方、TRPM2欠損マウスから単離した細胞では認められなかった。また、野生型マウスの左心房、左心室および右心房から単離した細胞にADP-riboseを導入しても内向き電流は認められなかった。以上のことから、心臓においてTRPM2チャネルは大静脈洞近傍に局在して機能的に発現していることが示された。大静脈洞近傍には心臓のペースメーカー（洞房結節）が存在していることから、ペースメーカー調節におけるTRPM2チャネルの関与に興味が持たれる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、心臓におけるTRPM2チャネルの局在とその役割を明にすることを目的に研究を進めている。平成２７年度の研究で、TRPM2 mRNAが右心房に発現していることをRT-PCR法で見出し、さらに大静脈洞の周辺部にTRPM2 mRNAが発現していることをin situ ハブリダイゼーション法で見出した。しかし、抗TRPM2抗体を用いた免疫染色法でTRPM2タンパク質発現の確認を試みたが、結果を得ることはできなかった。現在、数種類の抗TRPM2抗体が購入可能であることから、今後他の抗TRPM2抗体を準備しタンパク質レベルでの発現解析を行う予定である。また、当初の予定では、TRPM2が発現している細胞の同定を行う予定であったが、これについても今後の課題である。このように、心臓におけるTRPM2タンパク質の発現確認、およびTRPM2発現細胞の同定までには至らなかったが、電気生理学的手法により大静脈洞周辺部の細胞においてTRPM2の活性を測定することに成功した。一方、TRPM2欠損マウスより単離した大静脈洞周辺部の細胞では、TRPM2活性が認められなかった。以上の結果から、心臓においてTRPM2チャネルが大静脈洞近傍に局在して機能的に発現していることが認められた。このように、研究はほぼ計画した通りに進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

平成２７年度に引き続いて、心臓におけるTRPM2発現をタンパク質レベルで測定する。また、TRPM2 mRNA発現およびTRPM2チャネル活性が認められた大静脈洞周辺部の細胞が、洞房結節細胞であるか同定を行う。心臓の房室結節細胞は、洞房結節細胞と類似した性質を持つ。そこで、房室結節細胞にもTRPM2発現が認められるか測定する。ここまでの研究で、心臓のどこの細胞に機能的なTRPM2が発現しているか明らかにできる。次に、TRPM2が心臓のどのような機能に関わっているのかについて検討を進める。マウスより心臓を摘出し、摘出心臓潅流標本を作製して、心機能の変化（心電図、左心室圧）や心筋壊死を測定する。最初に、心臓においてTRPM2が機能することを確認するために、TRPM2 を活性化する過酸化水素の添加、温度上昇（36℃＞）実験を行う。次にβ1受容体刺激、虚血再灌流への暴露、ドキソルビシンの導入実験などを行うことにより、多面的に心臓機能における TRPM2の役割を解析する。なお、これらの実験では、WT マウスの心臓と TRPM2欠損 マウスの心臓の比較で行う。最近、我々はチロシンキナーゼ阻害剤として開発されてきたTyrphostin AG関連化合物が強いTRPM2阻害作用を有していることを明らかにした。そこで、Tyrphostin AG関連化合物を用いて心臓におけるTRPM2の役割の解析も併せて行う。

Causes of Carryover

平成27年4月に横浜薬科大学から帝京平成大学に異動した。そのため、TRPM2欠損マウスを帝京平成大学で繁殖する準備に時間がかかり、若干研究が遅れたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現在は、TRPM2欠損マウスの繁殖が順調に進んでいる。平成28年度は、繁殖数を増やして研究を推進する。