2015 Fiscal Year Research-status Report

ムスカリン受容体を介するリンパ球コリン作動系のT細胞分化における生理的役割の解明

Research Project

Project/Area Number	15K07979
Research Institution	Doshisha Women's College of Liberal Arts
Principal Investigator	藤井健志同志社女子大学, 薬学部, 教授 (80255380)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	間下雅士同志社女子大学, 薬学部, 助教 (30738886)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	アセチルコリン / ムスカリン受容体 / T細胞 / カルシウムシグナル / サイトカイン / フローサイトメトリー / 制御性T細胞
Outline of Annual Research Achievements	免疫機能調節におけるアセチルコリン（ACh）の役割を解明していく目的で、T細胞の活性化および分化におけるムスカリン性ACh受容体（mAChR）の関与を解析した。１．mAChRの細胞内カルシウムシグナルへの関与：T細胞をサブタイプ非選択的mAChR作用薬オキソトレモリン-M（Oxo-M）で刺激したところ、一過性カルシウムシグナル上昇に続くオシレーション反応が観察された。転写調節因子c-fosの遺伝子発現も増強されていた。オシレーション反応およびc-fos遺伝子発現増強にはカルシウム遊離活性型カルシウムチャネルが関与していることが明らかとなった。２．T細胞分化におけるAChの役割：抗CD3抗体+抗CD28抗体によるナィーブT細胞のTh1, Th2および制御性T細胞への分化誘導に対して、Oxo-Mは影響を及ぼさなかったが、α7型ニコチン受容体刺激薬は影響を及ぼした。mAChRとnAChRとではT細胞の分化における役割が異なることが判明した。３．mAChRのサイトカイン発現における役割：T細胞活性化薬フィトヘマアグルチニン（PHA）によるT細胞におけるIL-2の遺伝子およびたんぱく質の増大は、mAChR遮断薬スコポラミンでは抑制されなかったが、nAChR遮断薬メカミラミンでは抑制された。TNF-αについても同様であった。４．T細胞活性化のmAChR遺伝子発現に及ぼす影響：mAChR遺伝子発現は、抗CD3抗体+抗CD28抗体、あるいはPHAによるT細胞の活性化により減少した。このメカニズムにはMAPK系が関与していることが明らかとなった。以上のことから、mAChRは直接的にナィーブT細胞の分化には関与していないが、分化誘導の初期段階において間接的に関与している可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason T細胞の活性化の初期段階（数時間以内）では、mAChR遺伝子発現は増強されることが以前の我々の研究で明らかになっている。しかしながら、分化誘導が行われた頃（数日）にはmAChR遺伝子発現は減弱していることが明らかになった。したがって、mAChRがナィーブT細胞の分化に直接は影響しない可能性が明らかになってきている。そこで、条件を再検討し、分化誘導の初期段階においてmAChRが関与している可能性についても検討したい。T細胞活性化に伴うmAChR遺伝子発現量の時間的な変化は、今回初めて見出された新知見であり、免疫機能調節におけるmAChRの重要性を示唆するものであると考えられる。関与するmAChRサブタイプ（M1～M5）の検討のために、siRNAを用いたmAChRノックダウン細胞の作製を試みたが、十分なノックダウン細胞が調製できなかった。したがって、siRNAおよび遺伝子導入条件を再度検討して実施する。今年度はmAChRの内因性リガンドであるACh合成・放出量の測定が十分でなかったので、平成28年度はこれらについても随時検討に加えていく予定である。研究成果については、国際学会（米国神経科学会）および国内学会（日本薬学会、日本薬理学会）において発表もしくは発表を予定している。mAChR刺激によるカルシウムシグナルに関する部分については現在欧文誌に投稿中である（Life Sciences誌）。
Strategy for Future Research Activity	現在のところ順調に進捗していることから、申請当初の研究計画をほとんど変更する必要はないと考えている。他方、免疫機能の研究に有用な２系統のマウス（DO11.10およびOT-II）を購入し、繁殖・維持を開始したことから、抗原提示プロセスへのmAChRの関与についても検討したいと考えている。さらに、今年度は新たに研究室内にもフローサイトメーターを導入することが決まっており、研究の進捗状況が向上することが期待できる。また、T細胞分化におけるnAChRの役割を解析する他のプロジェクトも同時に推進していることから、本プロジェクトとの比較検討からも免疫機能調節メカニズムにおけるアセチルコリンの役割が一層解明できるものと考えている。研究に従事する研究者の人員確保は研究のさらなる推進に重要であるが、平成28年度は共同研究者・間下雅士博士（同志社女子大学）、連携研究者・川島紘一郎博士（北里大学）に加えて、13名（5年次生4名、4年次生9名）の卒業研究生との研究が可能な状況になっている。さらに、9月初旬ごろからは3年次生も若干名が加わる予定になっており、新たな研究成果が随時得られている状況であることから考えても、一層研究を推進できる環境が整ってきている。現在は、リンパ球のモデル系（白血病細胞株）およびマウスリンパ球を用いて検討しているが、ヒト末梢血リンパ球（倫理的な問題をクリアしたものを購入する）を用いた検討も開始する予定である。
Causes of Carryover	T細胞分化に関する研究で得られた成果が一部十分でなかったことから、現在投稿中の論文以外に投稿を予定していた論文の作成に若干手間取っている。さらに、予定していた日本薬理学会年会への参加を見送ったこともあり、これらに充当する予定だった分が未使用になってしまった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	本研究課題を遂行するために必要な最新の設備・備品などはすべて整備されている。さらに、平成28年度は、別の資金で新たに導入するフローサイトメーターも使用できることになっている。したがって、平成28年度についても研究費は試薬および消耗品の購入、成果発表（学会発表、英文投稿論文の校閲代などを含む）に係る経費のためにのみ使用する。昨年度未使用分については、ほぼ投稿準備が整った論文の投稿費用（校閲代を含む）に優先して使用する。