2016 Fiscal Year Research-status Report
植物細胞内で多様な四環性ジテルペン骨格を選択的に産生する分子機構の解明
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15K07991
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
山村 良美 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (30464027)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 植物二次代謝 / ジテルペン / チトクロームP450 / 環化酵素 / 有用物質生産 / RNA-Seq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は「スコパリアの有用ジテルペンscopadulcic acid B（SDB）生合成に関与するチトクロームP450（P450）および環化酵素をコードする遺伝子群を“蓄積パターンが異なる器官”さらに“ジャスモン酸（JA）刺激に対する応答性の違い”を利用して単離および機能解析し、生合成機構を明らかにすること」である。前年度までに我々は次世代型シークエンサーを用いた網羅的なトランスクリプトーム解析（RNA-seq解析）を行い、SDB生合成に関与することが予想されるP450遺伝子（SdCYPs）や環化酵素遺伝子クローンについての候補を挙げることができた。
そこで本年度では、これらのP450遺伝子および環化酵素遺伝子（SdCPS2およびSdKSL1と命名）の分子生物学的解析を行った。まず、SdCPS2 およびSdKSL1について完全長cDNAを取得し、塩基配列を決定した。これらのコードする推定アミノ酸配列から、SdCPS2 はClass IIに、SdKSL1はClass Iにそれぞれ属している環化酵素であることが推定された。また、JA刺激に対するP450遺伝子および環化酵素遺伝子の発現の変動をリアルタイムPCRで解析した。その結果、JA処理3時間後でSdCPS2およびSdKSL1遺伝子の発現量が急激に増加していたが、SdCPS1およびSdKSに関してはその発現の変動はほとんど見られなかった。この結果は、JA処理によってSDB生合成が活性化されるという以前の我々の結果と相関性を示す結果である。また、SdCPS2およびSdKSL1遺伝子とほぼ同様の発現変動を示したP450クローンに関して、これらの遺伝子もSDB生合成に関与することが強く示唆された。
以上のことから、今回得られた知見はスコパリアのSDB生合成機構解明に向けた重要な情報である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は前年度に得られた環化酵素SdCPS2およびSdKSL1の遺伝子情報を基に全長cDNAの取得を試み、遺伝子配列を決定した。また、前年度のトランスクリプトーム解析で得られたP450分子種の中からSDB生合成に関与すると考えられるCYP71ファミリーおよびCYP76ファミリーを選抜し、その中でも、JA誘導性が確認できた12個のP450遺伝子をSDB生合成に関与する候補遺伝子とした。
特定したクローンについて、JA刺激に対する遺伝子発現の挙動について定量的リアルタイムPCR法を用いて解析した。その結果、スコパリアにおいて、SdCPS2、SdKSL1、SdCYP76B72、SdCYP76B73、SdCYP71CV1、SdCYP76D489の発現とSDB生合成の変動が密接に結びついていることが示唆できた。
以上の結果から、本年度予定していた研究計画においてはおおむね順調に進んでおり、次年度も引き続き研究目的を達成するための研究計画を遂行する。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に単離した全長SdCPS2クローンのシグナルペプチド部位をTMHMMまたはSignalPで予測する。予測された領域を切断したORF部位 (truncated SdCPS2, tSdCPS2)を大腸菌発現ベクター(pET系) に組み込み、発現用大腸菌株C41に導入する。発現を誘導した大腸菌から可溶性画分を調製し、タンパク質発現を確認した後、組換えtSdCPS2タンパク質をカラム精製する。基質（GGDP）と組換えtSdCPS2とをin vitroで反応させて、その反応産物をGC-MSで解析する。同時に、以前にイネから単離されているsyn-CPS（OsCPS2）をクローニングし、同様にして発現用pETベクターに組み込む。カラム精製後、基質（GGDP）と組換えOsCPS2とを反応させてGC-MS解析を行う。組換えtSdCPS2反応産物と組換えOsCPS2反応産物の各クロマトグラムで検出されるピークの保持時間およびMSスペクトルを比較することでSdCPS2がsyn-CPSであるかどうかを特定する。syn-CPSであることが明らかとなった場合、酵素量や反応時間依存的な挙動も解析する。基質以外にも類似構造をもつ化合物等を用いて基質特異性も解析する。
また、トランスクリプトーム解析で得られたスコパリア由来のテルペン生合成酵素(TPS)の候補遺伝子（19個）の解析にも着手する。
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| Causes of Carryover |
残額が生じてしまったが、これは論文掲載料分が次年度に持ち越されてしまったためである。本計画は順調に進んでおり、今年度の計画遂行に影響はない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
残額は論文掲載料（約20万円）および消耗品費として使用する予定である。
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