2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K08002
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
高松 智 昭和大学, 薬学部, 准教授 (30236351)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福村 基徳 昭和大学, 薬学部, 講師 (00407529)
小池 佑果 昭和大学, 薬学部, 助教 (10644479)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 老化 / 生薬 / 抗酸化 / SIRT1 / 線虫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酸化ストレスと老化・寿命は密接に関わっていることから、天然由来の抗老化化合物の探索を目的に、抗酸化作用の評価系として細胞内過酸化を測定するDCFH-DA法、化学反応ベースのDPPHラジカル測定法などの簡便な評価系を組み合わせて、96種の生薬エキスをスクリーニングした。その結果キョウカツ、トウキ、トウドクカツ、トウヒ、ロートコンの各エキスが酸化ストレスを軽減することを見出した。その内、長寿遺伝子産物SIRT1の活性化作用を有するものとして、これまでにトウドクカツ（セリ科シシウドAngalica pubescens Maxim.の根）より、xanthotoxin、ostholやbergaptenなど7種のクマリン誘導体を分離した。得られた化合物はSIRT1を1.2～1.8倍程活性化することが確認されたが、エキスの活性（約6倍）に比較して弱いものであった。他にも活性画分があることが予想されることから、活性成分の分離と活性評価を継続している。
また、当初計画した線虫を用いた生薬エキスの寿命延長評価も合わせて開始した。特にDCFH-DA法やDPPH法では蛍光色を有するエキスや化合物は抗酸化作用測定の妨げになるため、色の影響を受けにくい線虫を用いた評価系と併用して評価することにより、より生体に近い評価系でかつ効率的に有効な成分を見出すことができると考えている。
さらに、漢方で血圧、お血、頭痛など血液や水の循環に関わる症状の改善が期待できる処方やその構成生薬についても、順次線虫の寿命延長の観点から評価を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２７年度より継続している、peroxide感受性の蛍光色素とヒト骨髄性白血病細胞HL-60細胞を用いたDCFH-DA法とDPPH法を併用し、96種の生薬エキスについて抗酸化活性を測定したところ、両測定法でいずれも70%以上の抗酸化活性を示したものは現時点では見出されていない。また、遅れていた線虫による延命効果の評価を開始し、先のスクリーニングで中程度の抗酸化活性の見られた生薬アシタバ（セリ科アシタバAngelica keiskeiの葉）やガイヨウ（キク科ヨモギArtemisia princeps又はオオヨモギA. montanaの葉や枝先）の再評価並びに活性成分の特定を行っている。
これまでにキョウカツ、トウキ、トウドクカツ、トウヒ、ロートコンの各エキスが、寿命遺伝子産物のSIRT1を活性化（コントロールに対し2倍以上の活性化が見られたもの）することが観測された。特にトウドクカツとロートコンエキスは0.5 mg/mLで5.96、5.50倍（陽性対象：レスベラトロールは22.7μg/mLで1.8倍）のSIRT1の活性化をそれぞれ示した。活性が比較的強かった、トウドクカツのクロロホルム画分について、活性成分の分離を進めた。これまでに7種の化合物を単離し、xanthotoxinやosthol、bergapten、demethyl-auraptenol、isoimperatorinなど計7種のクマリン誘導体を同定した。しかし、単離された化合物はSIRT1を1.2～1.8倍程活性化することが確認されたが、エキスの活性（約6倍）と比較して弱いものであった。
今後は、各化合物の抗酸化活性や線虫の寿命延長など多方面から抗老化作用を検討する。また、トウドクカツエキスの他の有機溶媒画分、アシタバやガイヨウ中の抗酸化成分の探索を継続する。
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| Strategy for Future Research Activity |
一次スクリーニングでは化学反応ベースのラジカル消去能を測定するDPPH法と細胞内過酸化物を検出するDCFH-DA法を併用して実施したが、期待できるほどの活性を示したエキスは見出されなかった。しかし、抗酸化活性が中程度でも、細胞毒性の見られないエキスについては線虫を用いた延命評価で再検討し候補を絞ってゆく。
また、スクリーニングライブラリーの拡充のため、より多くの生薬サンプルの入手に加え、他に植物の種子、球根など天然素材の入手を試みる。特に、植物の発芽時には、外敵に対する防衛の点から特殊でユニークな化合物を蓄積することも期待できることから、発芽体のエキスを可能な限り調製し、今後供給したいと考えている。
平成29年度も引き続き、SIRT1の活性化の評価は、抗酸化物質のスクリーニングと並行して実施する。
線虫に対する寿命延長効果の測定も従来の細胞系、非細胞系の抗酸化評価スクリーニングと併用して実施する。また、ストレスによる血管内皮の障害と老化の関係は古くから知られており、漢方処方の中で高血圧、お血、頭痛に効果のあるとされているものを優先的にリストアップして、評価対象とする。
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| Causes of Carryover |
平成27年度と同様にスクリーニング評価の継続のために、生薬や植物の入手に関わる費用、培養細胞、線虫の飼育維持のための培地、血清、培養器具一式、評価対象の成分分析や分離・精製に要する有機溶媒や各種試薬、機器測定の費用、そして成果発表のための学会や関連シンポジウムの参加費用として、平成28年度とほぼ同額の予算を計上している。
また、平成29年度の申請額は、作用機序の解明や動物評価系の実施に関わる準備費用が新たに生じ、それに伴う実験手技の取得やそれらに関する講習会に参加するための講習費用や交通費の支出、スクリーニングに供する天然素材の拡充のために、平成28年度の未使用額と合わせて使用する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度の申請額は消耗品費として、評価試験に関わる器具や試薬に80万円、化合物の分離・構造決定に10万円、天然素材の入手に20万円、学会参加費用に34万円、専門知識、技術の取得、講習会の参加に11万円、論文の投稿に関わる費用として、8万円の計163万円の使用を見込んでいる。また、平成28年度の未使用額は、天然素材の入手の拡充と抗酸化化合物の作用機序解明の費用に充てる予定である。
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