2016 Fiscal Year Research-status Report
食物アレルギーにおけるアレルゲン経皮感作のメカニズム解析及びマーカー分子の探索
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15K08061
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
安達 玲子 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 室長 (10291113)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 食物アレルギー / 経皮感作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、食物アレルギー発症における経皮感作経路の重要性が指摘されている。本研究では、食物アレルゲンタンパク質による経皮感作のメカニズム等の解析、及び経皮感作の指標となるマーカー分子の探索を行う。本研究により、経皮感作による食物アレルギー発症の防止に資する有用な成果が得られるものと考える。
本研究で用いた経皮感作実験系の概要は次のとおりである。①マウス背部を剃毛し、ヒト皮膚テスト用パッチを用いて食物アレルゲンタンパク質を貼付（3日間／週×4週）。 ②感作過程で部分採血し、抗原特異的IgE抗体等の産生を確認。 ③感作終了後、抗原を腹腔内投与してアナフィラキシー反応を惹起し、Th2型免疫応答（Ⅰ型アレルギー）が誘導されたことを確認。
27年度は、皮膚におけるTh2型免疫応答の誘導に重要な役割を果たすサイトカインであるTSLP（Thymic stromal lymphoprotein）に着目し、経皮感作時の血中TSLP濃度に関して検討したが、感作群と対照群との間に有意差は見られなかった。28年度は、抗原感作部位である皮膚において発現が変動する遺伝子の探索を行った。各種サイトカインやケモカイン、およびTSLP等のmRNA発現量を検討したが、有意に発現が変化する遺伝子は認められなかった。そこで次に、抗体産生の場と予測される所属リンパ節に関する検討を進めた。その結果、抗原感作マウスの所属リンパ節は対照マウスと比較して肥大しており、B細胞数が有意に増加していることを明らかにした。今後さらに解析を進め、経皮感作によりアレルギー病態を発症する原因となるB細胞サブセットを同定し、またT細胞の影響等を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アトピー性皮膚炎においては、ケラチノサイト（表皮の主要な構成細胞）が産生するサイトカインであるTSLPがTh2型免疫応答を誘発する重要な因子として報告されている。そこで27年度においては、食物アレルゲン経皮感作時の血中TSLP濃度について検討した。卵白アルブミン（OVA）を用いて経皮感作を行い、血中のTSLP濃度を測定した。その結果、経皮感作は進行したが、血中TSLP濃度に関しては感作群と対照群との間で有意差は見られなかった。
そこで28年度は、感作部位である皮膚において発現が変動する遺伝子の探索を行った。経皮感作後のマウスから感作部位の皮膚を採取し、得られた組織片からRNAを精製して、アレルギー応答との相関が知られているサイトカインやケモカイン、及びTSLP等のmRNA発現量の変動について検討した。その結果、検討対象の中に発現が有意に変化する遺伝子は見られなかったことから、この手法では経皮感作メカニズムの解明は困難であると予想された。
食物アレルギーの発症は抗原特異的なIgEの増加が原因であると考えられており、その増加にはT細胞やB細胞が重要な役割を担っている。そこで次に、抗原特異的抗体産生の場となる所属リンパ節中の細胞の割合に関して検討した。その結果、経皮感作マウスの所属リンパ節は対照マウスと比較して肥大しており、B細胞数が有意に増加していることが明らかになった。現在、B細胞のクラスをさらに細分化して検討し、アレルギー病態発症において重要な細胞を同定するべく解析を継続している。
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| Strategy for Future Research Activity |
前述のように食物アレルゲンの経皮感作において、血中TSLP濃度は感作の良好な指標にはならないことが明らかとなった。1つの理由として、TSLPは感作部位において局所的に産生されるため、末梢血中に拡散すると濃度が低下するという可能性が考えられる。そこで、感作部位である皮膚を採取して、アレルギー応答との相関が報告されているサイトカインやケモカイン、及びTSLP等のmRNA発現量を検討したが、経皮感作に伴い有意に変動するものは見られなかった。次に、抗体産生の場である所属リンパ節について解析した結果、経皮感作マウスの所属リンパ節は対照マウスに比べ肥大しており、B細胞数が有意に増加していることが明らかになった。
今後はさらに解析を進め、経皮感作時の抗原特異的抗体産生に重要なB細胞サブセットを特定し、さらに、当該B細胞サブセットの増殖・抗体産生に対するT細胞等の影響及びそのメカニズム（関与するサイトカインの同定等）に関する解析を進める。また、経皮感作時に重要となる皮膚の抗原提示細胞に関する蛍光標識アレルゲンを用いた細胞種や機能の解析、感作部位において発現が変動する遺伝子に関する網羅的な解析等についても実施し、アレルゲンタンパク質による経皮感作からアレルギー発症にいたるメカニズムの解明、及び経皮感作の指標となるマーカー分子の探索を行う。
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| Causes of Carryover |
28年度においては、経皮感作部位である皮膚におけるサイトカイン・ケモカイン類のmRNA発現に関する検討を中心として研究を進めた。従って、経皮感作実験を実施するために必要な実験用マウスや抗原、抗原貼付及び感作・アナフィラキシー反応惹起に関するアッセイに必要な試薬・器具類、mRNA発現解析に必要な消耗品類の購入を中心として研究費を使用した。しかし、経皮感作により発現が有意に変動するmRNAが検討対象中に見られなかったので、サイトカイン類に関するその後の詳細な検討は行わなかったため、当初購入を予定していた試薬・器具類の一部を購入せずに28年度の検討が終了した。従ってその差額は29年度の検討において使用することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
29年度においては、経皮感作における所属リンパ節のB細胞及びT細胞に関する詳細な解析、及び、皮膚の抗原提示細胞に関する解析や遺伝子発現変動に関する網羅的解析を進める予定であり、そのために必要な試薬・器具類を中心として消耗品を購入する。また、マウスを用いる経皮感作実験の実施が必須であるため、27・28年度と同様に、実験用マウスや抗原、あるいは抗原貼付及び各種アッセイに必要な消耗品類等、支障なく研究を進めるために必要な試薬・器具類を適宜購入する。
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[Journal Article] Food allergen analysis for processed food using a novel extraction method to eliminate harmful reagents for both ELISA and lateral-flow tests.2016
Author(s)
Ito K, Yamamoto T, Oyama Y, Tsuruma R, Saito E, Saito Y, Ozu T, Honjoh T, Adachi R, Sakai S, Akiyama H, Shoji M
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Journal Title
Anal Bioanal Chem
Volume: 408
Pages: 5973-5984
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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