2015 Fiscal Year Research-status Report
膜裏打ちタンパクの制御による臓器特異的ながん多剤耐性の非働化
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15K08078
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| Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
荻原 琢男 高崎健康福祉大学, 薬学部, 教授 (80448886)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 健太郎 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助手 (40644290)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | P-糖タンパク / radixin / 消化管がん / 腎臓がん / トランスポーター / 多剤耐性 / 組織差 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
P-糖タンパク質（P-gp）は薬物の排出を調節しており、多剤耐性に寄与している。27年度では消化管がん細胞のP-gpの輸送機能が、radixinと呼ばれる足場タンパクによって調節されている一方で、腎臓がん細胞のP-gpはezrin、radixin、moesin（ERM）いずれの足場タンパクによっても機能調節されていないことを報告した。
ヒト消化管がん由来細胞（Caco-2細胞）およびヒト腎臓がん由来細胞（Caki-1細胞）においても、ヒト肝臓がん細胞やマウス消化管と同様、P-gpの輸送機能にERMタンパクが関与しているか否かを検討した。P-gpの輸送機能は、siRNAを用いて各ERMタンパクの遺伝子発現を抑制し、P-gpの基質薬物であるrhodamine123（Rho123）の細胞内蓄積量の変化から評価した。その結果、Caco-2細胞においてはradixinの遺伝子発現を抑制したときのみ細胞内蓄積量が増加し、P-gpの機能低下が示唆された。さらに、受動拡散マーカーであるエバンスブルーを用いて検討したところ、ERMの遺伝子抑制は細胞膜透過性に変化を与えていないことが示された。これらのことから、radixinはP-gpの輸送機能をダイレクトに調節している一方で遺伝子発現には関与していないことが示唆され、以前に我々が報告している正常なマウス消化管の結果と一致した。また、ezrinおよびmoesinの遺伝子抑制は、いずれもRho123の細胞内蓄積量を変化させなかったため、P-gpの輸送機能の調節には関与していないと考えられた。加えて、Caki-1細胞におけるP-gpの輸送機能は、ERMいずれの遺伝子抑制によっても変化しなかった。正常マウスの結果および報告と照らし合わせると、正常とがんではP-gpの機能調節因子に違いはないものの、組織によって異なっていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
27年度では、ヒトがん細胞のP-gp輸送機能とERMによる機能調節を確認するため、①各種排出系トランスポーター(TP)の輸送機能が見られるヒトがん細胞の選抜、②膜裏打ちタンパクによるTPsの機能調節を検討することを達成目標としていた。まず①に対して、ヒト消化管がん由来細胞としてCaco-2細胞、ヒト腎臓がん由来細胞としてCaki-1細胞を用いてP-gpの輸送機能を評価したところ、十分に機能していることを確認した。この他にもヒト乳がん由来細胞(MCF-7)を用いたが、P-gpの発現が低く輸送機能が十分に評価できなかった。MCF-７に関しては、抗がん薬であるドキソルビシンを長期かつ段階的に濃度を上げて添加することで、P-gpが高発現した耐性株を樹立できることが報告されている。そこで、同様の方法による薬剤耐性株の樹立を開始しており、既に報告されている最大濃度の2/5に相当する200 nMにおいても増加しうる、薬剤耐性株が得られてきている。また、P-gp以外のがん多剤耐性に寄与する排出系トランスポーターであるBreast cancer resistance protein (BCRP)やMultidrug resistance associated protein (MRPs)もCaco-2で輸送機能を有しているのかを検討しており、次年度には排出系トランスポーターに関する一連の結果を公表できるものと考えている。次に、これらの細胞を用いた②の検討に関してCaco-2細胞のP-gp輸送機能においては、radixinのみが関与していた一方で、ヒト腎臓がん由来細胞においては、ezrin、radixin、moesinのいずれもP-gpの輸送機能の調節には関与していなかったことを明らかにした。以上より、当初の予定の①および②の検討は、おおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画どおり、まず各種がん細胞のMRPおよびBCRPの機能調節因子にERMいずれのタンパクが関与しているのかを明らかにする。具体的には、small interfering RNA (siRNA) あるいはclustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins (CRISPR-cas9) などの遺伝子編集技術を用いて、Caco-2細胞などのERM各タンパクの遺伝子発現を抑制する。その細胞にMRPやBCRPの基質薬物を取り込ませ、細胞内蓄積量を測定することで輸送機能を評価する。もしCaco-2細胞において、radixinがP-gpだけでなくBCRPなどの機能調節にも関与していることが明らかになれば、radixinの抑制が網羅的な排出系トランスポーターの機能抑制につながると考えられる。さらに、これらのERMの発現を抑制したがん細胞をマウス皮下に注入することで担がんマウスを作製する。これにP-gpおよびERMが機能調節に寄与する排出系トランスポーターの基質となる抗悪性腫瘍薬を投与し、薬物の腫瘍集積性および抗腫瘍効果が増大することを確認する。以上の検討を論文発表等を通して広く公開し、抗悪性腫瘍薬が標的組織で十分に薬効を発揮するためには、ERMを標的とした創薬が有用であることを示す。並行して、ERMいずれかのタンパクによって排出系トランスポーターの機能が調節されているがん細胞を用いて、そのERMを活性化する因子を同定する。順調に検討が進めば、29年度末までには足場タンパク自体の抑制とその活性化因子の抑制のいずれの方法が、抗がん薬による担がんマウスの腫瘍縮小効果の増強および正常組織への毒性回避に有用であるのかを示すことができ、新規創薬標的を提案できるものと考えている。
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[Journal Article] Interaction of Peptide Transporter 1 With d-Glucose and l-Glutamic Acid; Possible Involvement of Taste Receptors.2016
Author(s)
Arakawa H, Ohmachi T, Ichiba K, Kamioka H, Tomono T, Kanagawa M, Idota Y, Hatano Y, Yano K, Morimoto K, Ogihara T.
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Journal Title
J Pharm Sci.
Volume: 105
Pages: 339-342
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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