2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
15K08144
|
|---|
| Research Institution | Tsukuba International University |
|---|
Principal Investigator |
澤田 和彦 つくば国際大学, 医療保健学部, 教授(移行) (10284324)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣瀬 美和 (堀内美和) 茨城キリスト教大学, 看護学部, 講師 (90381714)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 大脳皮質 / 脳溝 / 脳回 / バルプロ酸 / MRI / 神経幹細胞 / フェレット / 免疫組織化学 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成27および28年度は、脳回形成が最も盛んになる5～7日齢にバルプロ酸(VPA; 200 mg/g体重)を投与した雄フェレット仔について、投与直後(7日齢)およびVPA最終投与13日後(20日齢)の脳のサンプリングを行った。VPA投与直前に新生する細胞を標識するため、投与の2時間前にEdUを腹腔内投与し、更にVPA投与後に新生する細胞を標識するためVPAの最終投与時にBrdUを腹腔内投与した。取り出した脳については順次T1強調MRIの計測を行った。MRI画像をもとに3Dボリュームレンダリングイメージを作成したところ、20日齢のVPA投与群で頭頂領域の脳回(上シルビウス回)の発達が対照群に比べてよくないことが明らかになった。また、MRI計測後の脳の組織切片を作成し、免疫組織化学解析の予備実験(条件検討)を試みた。7日齢の仔においてはEdU、BrdU、Pax6(basal radial gliaを標識)の免疫蛍光三重染色に、20日齢の仔においてはEdU、BrdU、Parvalbumin(一部のGABA作動性ニューロンを標識)の免疫蛍光三重染色にそれぞれ成功した。7日齢の対照群では、脳室下帯外層(oSVZ)でEdU+BrdU+Pax6三重陽性細胞がみられ、2回の分裂を経験したbasal radial glia (bRG)の標識に成功した。更に、20日齢の対照群においては大脳皮質Ⅱ層の浅部でEdU＋BrdU二重陽性細胞(5日齢および7日齢に二度の分裂を経験しているbRG由来であると考えられる)がみられ、更にEdU+BrdU二重標識細胞のほとんどがParvalbumin陽性であることを確認した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27および28年度で12例の妊娠動物から計19例の雄仔を得た。このうち9例に脳回形成が最も盛んになる直前(5～7日齢)にバルプロ酸(VPA; 200 mg/g体重)を腹腔内投与した。VPA投与直前に新生する細胞を標識するため、投与の2時間前にEdUを腹腔内投与し、更にVPA投与後に新生する細胞を標識するためVPAの最終投与時にBrdUを腹腔内投与した。対照には10例にEdUとBrdUのみ投与した。VPA投与群5例と対照群4例の仔(7日齢)に対してBrdU投与の2時間後に灌流固定を行い脳を取り出した。残りのVPA投与群4例と対照群6例の仔については20日齢まで生存させ、灌流固定を行い脳を取り出した。
取り出した各群仔の脳のT1強調画像を7-tesla MRI装置を用いて取得した。MRI画像をもとに3Dボリュームレンダリングイメージを作成したところ、20日齢のVPA投与群で頭頂領域の脳回(上シルビウス回)の発達がよくなかった。また、MRI画像取得後の一部の動物の脳の凍結切片を作成し、免疫組織化学解析の予備実験(条件検討)を試みた。7日齢の仔においてはEdU、BrdU、Pax6(basal radial gliaを標識)の免疫蛍光三重染色に、20日齢の仔においてはEdU、BrdU、Parvalbumin(一部のGABA作動性ニューロンを標識)の免疫蛍光三重染色にそれぞれ成功しており、組織定量評価の準備が整いつつある。
以上の様に28年度までに予定していたフェレット脳のサンプル採取は完了し、順次MRI計測および定量解析を進めている。更に組織解析のための準備も整いつつあることから、研究計画はおおむね順調に進んでいると思われる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
得られた脳のT1強調MRI画像について、MRI画像解析ソフトを用いて①大脳皮質の容積、②大脳皮質厚、③脳回形成頻度(sulcation index)、④脳溝形状の解析を行い、VPA投与による神経幹細胞の分化誘導が及ぼす各パラメータへの影響をVPA投与直後(7日齢)と脳回形成完了時(20日齢)とで検討する。
また、MRI画像取得後、脳の組織切片を作製し、抗EdU抗体、抗BrdU抗体および各種神経幹細胞に対する抗体を用いて免疫染色を行い、これらの抗体で標識された細胞の数を定量評価する。
|
| Causes of Carryover |
平成28年度までに本研究に必要な動物が一通り揃ったため、残りの資金は、今年度実施する免疫組織化学解析に必要な抗体等の試薬の購入に充てる予定である。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度はMRI画像の定量解析と並行して、凍結切片の作成と免疫組織化学解析を中心に行う予定である。平成28年度に未使用だった資金は、今年度実施する免疫組織化学解析に必要な抗体等の試薬の購入に充てる予定である。
|
