2016 Fiscal Year Research-status Report
四肢動物の祖先モデルとしての古代魚ポリプテルスの実験動物化にかかる基盤整備
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15K08145
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
岡部 正隆 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (10300716)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 十織 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (10648091)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ポリプテルス / 遺伝子組換え / 形態形成 / 進化 / 発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究実施計画に従って（１）採卵法の改善と（２）遺伝子組換え個体作製、さらにはこれら技術を利用した（３）新規研究テーマの抽出を行った。
（１）本研究課題において達成すべき項目の1つ目として、人工授精技術の確立がある。前年度同様にポリプテルス成魚の流通量は本年度も少なく、したがって現在飼養中の個体を用いた繁殖により、積極的に個体数を増やす戦略をとってきた。昨年度得た受精卵は本年度末までに性成熟直前の若魚へと成長し、また昨年度若魚であった個体は繁殖可能個体へと成長を遂げるなど、ポリプテルス飼養設備における水循環システムの若干の改変により、現飼養設備は非常に安定な飼育環境へと整備された。
（２）本研究課題において達成すべき項目の2つ目として遺伝子組換え技術の確立があるが、前年度において既に達成済みである。本年度はCRISPR/Cas9法を用いた遺伝子ノックアウト実験を行った。色素細胞形成や骨形成、付属肢（鰭）形成にかかわる各種遺伝子のノックアウト用gRNA溶液を精製し、受精卵にインジェクションを行ったが、受精後3日を超えて発生する個体を得られなかった。Tol2 transposonを用いた遺伝子組換え溶液をインジェクションした場合には経験しなかった結果であった。また粘着性の高い受精卵を回収するためには、人工産卵床から機械的に引き離す必要があるが、人工産卵床に付着した状態で発生させたコントロール個体群は非常に高い発生率を示すことが分かった。
（３）ポリプテルスの特殊性に留まらない、基礎医学・生命科学研究に広く波及が期待できる新規研究テーマの抽出は、（１）、（２）による研究技術開発と並行して行ってきた。本年度は特に硬組織形成・感覚器形成・眼形成に着目して解析を行い、成果の一部は国内外の学会発表にて公表した。また国内共同研究の成果として2報の論文を公表し、さらに新規共同研究の締結を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
人工授精法を検討するには生殖可能個体数の十分な確保が必要であるため、他実験系や共同研究の遂行を妨げない綿密な計画が必須である。したがって本年度の産卵時期（春から秋）は人工授精法の検討を実施すべきでないと判断した。本年度末には生殖可能個体数の十分な確保ができ、また採卵も成功したため、研究に支障のある遅れには至っていないと考えられる。さらに遺伝子組換え技術の検討や新規テーマの検討に関しては順調に進展がみられたため、研究計画を立案した当初に予期した通りの進捗状況であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）人工授精法の検討については、次年度に実行可能であるため、研究計画通りに遂行していく。
（２）においてCRISPR/Cas9法が上手く機能しなかった点については、インジェクション溶液の組成を変えて再度行うことで解決できると考えている。また人工産卵床からの採卵が胚発生率を低下させている可能性が浮上したが、これは（１）の進捗によって解決できる。一方で野生型胚を得る場合には人工産卵床を水槽内に維持したまま発生させることで、今まで以上にサンプルを得ることができるのではないかと期待している。
（３）前年度は研究分担者1名がポリプテルスの交配から採卵に至るまでの過程を遂行していたが、本年度末からは交配に関わる技術を会得した研究者を研究グループ内に1名増員した。したがって次年度はよりスピーディーな計画の遂行が可能となり、計画以上の進展として（１）や（２）の技術を応用した研究テーマの遂行が見込めると考えられる。
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| Causes of Carryover |
人工授精法の検討及びCRISPR/Cas9法によるゲノム改変個体獲得の困難から消耗品費の支出が滞った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
人工授精法の検討及びCRISPR/Cas9法によるゲノム改変個体獲得を進めていく中で消耗品費として支出していく計画である。
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