2017 Fiscal Year Research-status Report
DNAメチル化による、精巣幹細胞に必須な転写因子を介した幹細胞分化制御機構の解明
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15K08156
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
大保 和之 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (70250751)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 幹細胞 / エピジェネティクス / 生殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで、精巣幹細胞の自己複製、増幅、分化制御のメカニズムについて、ゲノム修飾の視点から解析を行って来た。幹細胞領域においては、その絶対的な数の少なさから、十分に純化されていない材料を用いた研究が多い。本研究では、GFPが精巣幹細胞、前駆細胞に発現する遺伝子改変マウスを用い、高度に純化した細胞を材料に実験を行って来た。既に得られていた全ゲノムレベルでのDNAメチル化解析の結果を俯瞰しても、メチル化のみでは細胞の特性を醸し出す複雑な遺伝子制御機構を説明することは困難であり、これに他のゲノム修飾、遺伝子発現を重ね合わせて、総合的に判断する必要があると考えられた。本研究で、これまでにエンハンサー、シードエンハンサーなどを同定するために、H3K4me1, H3K27Ac, H3K4me3などの修飾部位を同定してきた。これに加えて、抑制性ヒストン修飾のH3K9me2の修飾も、マウスから純化した精巣幹細胞、前駆細胞を用いて行い解析を進めつつある。H3K9me2修飾は、ゲノム上に台形上に修飾が入れられていた。このことは、H3K9me2の抑制領域は、一定以上の連続した長さで意味のあるゲノム上の領域に修飾を加えており、一部は幹細胞と前駆細胞で領域が異なった。このような修飾パターンは、これまでの研究から、核内配置の決定に関わる可能性が高いと考えられた。これに加えて、これまで当教室では経験がなかったDNA-FISHを行う予定であったが、その遺伝子座に存在する遺伝子の発現も観察する必要があるため、DNA-FISHに加えて、RNA-FISHも同時に行うこととした。幹細胞分化制御に必須と考えられる遺伝子領域２箇所を対象としてプローブを作成し系を立ち上げた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究でH3K9me2の修飾状況は、既にデータを取得しゲノム上での修飾部位の同定が進んでおり、ES細胞で報告されているように台形状の修飾となっていることが確認され、H3K9me2のクロマチン沈降実験そのものは上手くいっていると考えている。そこで現在、マウス個体から得られた精巣幹細胞、前駆細胞を用いて、これまでの本研究で得られたH3K4me1, H3K27Acの結果に加え、他の研究費で得られた遺伝子発現、DNAメチル化、H3K4me3、H3K27me3の結果を重ね合わせ解析を行っている。ヒストン修飾のH3K4me1, H3K27Ac, H3K4me3の３つは、遺伝子の発現を上げる分子機構に関連する修飾であり、H3K9me2、H3K27me3は逆に遺伝子の発現を抑える分子機構に関わる修飾となる。現在、精巣幹細胞と前駆細胞の境目で、これらの修飾が大きく変化する領域を同定するとともに、特に遺伝子発現の動きを、これまで公共データベースに公開されている初期発生、始原生殖細胞などのデータの中から信頼性が高そうなものと照らし合わせながら、精巣幹細胞を中心に、どのようなパターンがあるか、さらに発生進行に伴いゲノム修飾がどのように変化していくのか解析中である。例えば、H3K4me1とH3K27Acは、エンハンサーをマークすると言われているが、精巣幹細胞においてアクティブなエンハンサー状態になっている領域（そこが支配する遺伝子も発現している）が、初期発生から始原生殖細胞を経て精巣幹細胞になる際に、どのような時期に樹立されるのか、さらに前駆細胞へ以降する際にどのようになるのかパターン分けを試み、大まかには５つの代表的パターンがあることが分かった。DNA-FISH、RNA-FISHに関しては２箇所の遺伝子領域を代表例に検出可能な実験系を樹立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨今、全ゲノムレベルでの遺伝子発現、エピゲノム解析が盛んであり、その結果から、細胞分化に関する様々な仮説が提唱されている。実際自ら行ってみると、ヒストン修飾といった特異抗体に関する非常に多くの知見の蓄積のあるものは信頼性が高いが、それ以外については、用いる抗体の質、量、細胞の純度、細胞腫の違いなどで結果が左右されるものも多いと考えられた。従って、大量の情報を含む結果が得られた後、これまでの蓄積されてきた個々のレベルでの遺伝子解析でのデータと慎重に照らし合わせ、矛盾がないのか慎重な検討が必須である。今後、これらの経験を元に、信頼性が高い特にゲノム修飾と遺伝子発現のデータから、精巣幹細胞から前駆細胞へとの分化時に大きく変わる部位を丁寧に拾い上げ、領域特異的配列の同定、核内配置の変化などの解析を積み重ね、どのような法則があるか検索を継続する予定である。
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| Causes of Carryover |
平成29年度に観察する予定であった、ターゲットとして絞るゲノム領域の絞り込みが遅れたため、ターゲットとするゲノム領域の３次元的核内の同定実験が次年度にずれこんだため。次年度に、FISH用に関連する分子生物学実験用試薬、キットなどの購入を計画している。
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