2017 Fiscal Year Research-status Report

上皮組織構築における細胞接着－細胞骨格インターフェースの機能解析

Research Project

Project/Area Number	15K08158
Research Institution	Dokkyo Medical University
Principal Investigator	伊藤雅彦獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70270486)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2019-03-31
Keywords	上皮細胞 / 細胞接着 / 細胞骨格 / 腫瘍形成 / 癌細胞転移 / ARHGEF11 / スプライシング
Outline of Annual Research Achievements	上皮に由来する癌が浸潤・転移する過程には、上皮としての特徴を喪失し線維芽細胞様の状態に移行する上皮間葉転換Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT)が多くの場合関係している。EMTを起こした細胞は、極性や細胞間接着といった上皮としての特性を失い線維芽細胞様の状態に移行することによって細胞運動能が亢進するなど、浸潤・転移に有利な能力を獲得すると考えられている。またEMTは、個体の発生分化過程においても生じることから、EMTに関わる細胞内のプログラムを詳しく知ることは、医学的・生物学的に重要な課題と考えられる。そこで本研究では、上皮に特有な細胞間接着構造と細胞骨格をつなぐインターフェースとして働く分子に着目し、解析に取り組んできた。これまでに、上皮細胞間接着構造に局在して細胞骨格制御に働く分子としてZO-1とその結合分子ARHGEF11を同定している。非転移性癌細胞と転移性癌細胞の間でARHGEF11の発現について比較解析したところ、転移能の有無によって転写レベルおよびタンパク質レベルで差を示すことを見い出した。この発現差が浸潤・転移能に機能的に関係するか明らかにするため、ARHGEF11の過剰発現および発現抑制を培養癌細胞を用いて行ったが、発現変化を誘導しても浸潤能や細胞骨格構造への有意な影響を認めなかった。したがって、転移性癌細胞におけるARHGEF11の発現低下が浸潤・転移能の獲得に直接的に関与する可能性は低いものと考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ARHGEF11の発現を詳しく解析する過程で、非転移性癌細胞と転移性癌細胞では異なるアイソフォームが発現していることを見い出した。そこで、CRISPR/Cas9法を用いて、転移性癌細胞に発現するアイソフォームを欠損する細胞を作製した。樹立した細胞では、細胞骨格の構築および細胞形態が、転移性癌細胞に典型的な線維芽細胞様の状態から上皮細胞様に変化していた。また、細胞の運動能ならびに浸潤能が、元の転移性癌細胞に比較して大きく減弱し、さらには増殖能や生存能も低下していた。以上の結果から、転移性癌細胞に特異的に発現するARHGEF11アイソフォーム分子は、癌細胞の転移性形質に機能的に関与していることが示唆された。これらの結果を含め得られたデータを整理し、論文作成と投稿を行った。その結果、Oncotarget誌への掲載に至った。上皮が関わる主要疾患の一つ癌について、転移という極めて重大な現象に上皮細胞間接着と細胞骨格をつなぐインターフェースのアイソフォーム変化が関わっていることを明らかにし、報告することができたことから、おおむね順調に進展しているとした。
Strategy for Future Research Activity	癌細胞の浸潤・転移の過程にARHGEF11分子のアイソフォーム変化が機能的に関与しうることを、培養細胞ならびにマウスへの移植実験によって確かめることができたが、実際にヒト癌で起きているか、またどのステージで起きるのか、癌の種類・由来する臓器によって違いがあるか、等々の点について今後検討したいと考えている。また、ARHGEF11分子のアイソフォーム変化が細胞内でどのような分子経路に作用し、さらには協調して、浸潤・転移能に影響を与えているのか詳しく明らかにするため、樹立したARHGEF11遺伝子破壊細胞の遺伝子発現パターンの網羅的解析を行う。あわせて、非転移性癌細胞および転移性癌細胞各々に発現するアイソフォームごとに特有な結合タンパク質の同定を試みる。これらの解析を通じて、癌細胞が転移能を獲得する際に起きるアイソフォーム変化が、分子レベルでどのような経路を通じて細胞に影響を及ぼすのか、より具体的に明らかにし、癌の診断ならびに治療への応用の可能性を探っていきたい。
Causes of Carryover	（理由）該当年度においては、それまでに得られたデータのとりまとめ、ならびに論文の作成・投稿とリバイスに多くの時間が必要となったため、新たな実験への取り組みが予想以上に遅れることとなった。そのため、新規購入する試薬類が予定よりも減少したことが、次年度使用額が生じた主たる理由である。（使用計画）今後の推進方策で述べた課題の遂行に使用する計画である。具体的には、ARHGEF11遺伝子破壊細胞の遺伝子発現パターンについて網羅的解析を行うため、民間企業のmicroarray受託サービスを利用する。さらに、結合分子の同定実験に必要な試薬キット類の購入にあてる。またヒト癌の解析のために、市販されている様々なヒト検体サンプルの購入利用を行う予定である。同時に、適切な抗体の外注作製も行う。さらに、実験手法の習得や特殊な装置を使用するための他大学への出張、学会発表や論文発表のためにも使用する予定である。