ErbBシグナルを介する皮質高頻度発火型GABA神経の機能成熟調節作用

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08173
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 難波 寿明 新潟大学, 脳研究所, 助教 (90332650)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 神経栄養因子 / GABA / 発火特性 / γオシレーション / 統合失調症 / 動物モデル

Outline of Annual Research Achievements

上皮成長因子（EGF）やニューレグリン（NRG）は、それぞれGABA系の発達に対して拮抗する作用を持つ。これらを新生仔期に投与したマウスは、両者とも成熟に至り統合失調症様の行動異常が出現し、疾患モデル動物となることが知られる。自閉症や統合失調症などの発達障害が伴う精神疾患モデル動物の多くで、GABA伝達系の異常が見いだされてきているが、当該モデルでは、因子投与時の新生仔期におけるGABA系への影響が解析されているのみであり、行動異常が出現する成熟期でのGABA機能異常に着目した研究はなされていない。本計画では、生後発達期から青年期を経て成熟に至るまでの大脳皮質高頻度発火型GABA神経の機能成熟に対するEGFやNRGの作用を検討するものである。
本年度の計画により、in vivoでのGABA機能評価として、覚醒静止時と聴覚誘発性の脳波計測をEGF投与マウスで実施した。その結果、GABA機能が関与するとされるγ帯域を含む高周波数帯域のみでの誘発性電位の平均振幅と刺激試行間での位相の一貫性に異常が見いだされた。それに対し、静止時ではγ帯域を含むいずれの周波数帯域での脳波異常は検出できなかった。さらに組織学的解析からは内側前頭前皮質や前部帯状皮質において、GABA神経が特異的に保有するパルブアルブミンの染色性の低下も見いだされている。これらの成果は、2017年度の第40回日本神経科学学会に発表する予定である（演題登録済み）。また、NRG投与マウスにおいても内側前頭前皮質などの皮質領域で、パルブアルブミン染色性の低下を認めることができた。これらの結果は、新生仔期でのErbB受容体刺激が成熟大脳皮質における高頻度発火型GABA神経の機能成熟にも何らかの影響を持つ可能性を示唆するものである。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

EGFあるいはNRG投与マウスの両者で、新生仔期のみならず成熟時においても皮質領域特異的なパルブアルブミン発現性の低下が認められ、高頻度発火型GABA神経になんらかの機能成熟異常が見いだされる可能性が示されてきている。この点において、本課題全体としての計画は概ね順調に進行しているといえる。計画初年度より引き続きGABA機能のin vivoでの評価系として覚醒状態での脳波計測を行い、EGFモデルの聴覚誘発性電位におけるγ帯域を含む高周波数帯での異常が見いだされている。この計画は共同研究によって実施され、実験系の確立と脳波データ解析が順調に進行した。さらにEGF過剰発現トランスジェニック（TG）マウスを用いて同様にGABA機能の影響を脳波計測により評価した。このTGマウスでも同様に自発性脳波異常は認められなかった。また、聴覚誘発性の脳波に関しては、γ帯域を指標としたGABA機能異常を示す結果はまだ得られていない。その原因としては、驚愕反応閾値で評価した際の聴覚応答性が野生型と異なるため、この聴覚刺激を用いた評価系が適さなかった可能性が考えられる。
上記の組織学的解析、脳波解析の結果に基づき、成体EGF投与マウスのスライスパッチクランプ法による電気生理学的計測を開始した。前頭前皮質（内側前頭前皮質や前部帯状皮質など）を中心に計測を実施しているが、成体スライスでの高頻度発火型GABA神経からのホールセル記録の効率が向上せず、計画の進行がやや遅延している。

Strategy for Future Research Activity

成体動物スライスを用いた高頻度GABA神経の発火特性解析の効率化を目指し、前頭前皮質領域を主として生理学的計測を継続して実施する。これを計画の中心とすることでEGFモデルのパルブアルブミン陽性GABA神経の高頻度発火特性の異常を決定する。それにより脳波異常や組織学的解析に見いだされたデータの生理学的裏付けが得られるものと思われる。また並行して、電位依存性カリウムチャンネルの組織染色や皮質領域特異的なウェスタンブロッティングによるチャンネル蛋白発現の生化学的解析も試みることで、誘発性電位や組織染色によって明らかになったGABA機能異常に、GABA神経が特異的に保有する電位依存性カリウムチャネルが関与することを示す。また進行状況に応じて、EGF受容体欠損マウスなどにおいてもEGFモデルと同様にスライス解析を進行させ、これらの結果を相互比較することで、ErbBシグナル活性とGABA機能成熟との関連性を考察する。また状況に応じ、錐体細胞へのGABA神経支配やGABA神経へのシナプス入力等の検討も含めて計画を推進させる。
当初計画に掲げられたGABA機能を行動レベルで評価するといった点に関する計画は推進されていないが、脳波計測をin vivoレベルでの解析の主要なものとし、EGFモデル以外のマウスを用いた脳波計測を推進させる必要がある。

Causes of Carryover

次年度繰越額が生じた理由として、行動に伴うGABA機能評価がなされてきておらず、見込まれていた機器購入のための予算は使用されていない。またマウスの作成維持に関しては、EGF受容体コンディショナルマウスの作成やNRG投与マウスの解析が遅延している点があげられる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

成体脳スライス標本を用いた実験を実施するにあたり、標本保持のための温度管理設備を充実させる。また、投与用の組み換えNRGの購入や組織染色用の電位依存性チャネルタンパクに対する抗体などを充実させるために経費を使用する。またEGF受容体コンディショナル遺伝子欠損マウスの作成のため、受精卵移植や飼育維持のためにも費用を使用する。