2017 Fiscal Year Research-status Report
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15K08174
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
古家 喜四夫 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (40132740)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ATPシグナリング / ATP放出 / メカノバイオ / 機械受容 / ルミネッセンスイメージング / 低張刺激 / ルシフェリン-ルシフェレース / 乳がん細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はATP放出の多様さがどのように生じそれが生理学的にどのような意味を持つのかを私たちの開発したATPリアルタイムイメージング法を主体に解明し、ATP細胞間シグナリング系の全体像解明に寄与することを目的としている。これまでに組織・器官レベルの観測を可能にする低倍のマクロ顕微鏡を用いたATPイメージングシステムを構築し、ラット潅流摘出肺において気道を介して肺胞を膨張させる機械刺激によって肺胞だけでなくそれを取り囲む肺毛細血管においても一過性のATP放出を観測した。また、我々は低張刺激によるATP放出をリアルタイムにイメージングし、初代培養の正常乳腺上皮細胞とがん細胞を含む未分化株細胞とでは全く異なったATP放出パターンを持つことを見出した。未分化の細胞株に特異的にみられる散漫的持続的なATP放出は容量調節性Cl-チャネル(VRAC)の阻害剤であるDCPIBでのみ阻害されたことから、VRACががん細胞におけるATP放出経路であるとの仮説を立てている。この散漫的持続的ATP放出が、スフィンゴ脂質の代謝産物でがん周辺環境にも多く存在する炎症性物質Sphingosine-1-Phosphateによっても活性化されること、上皮間葉系転換を引き起こすTGFβ処理によって増大することなどを明らかにした。がん微小環境中には高濃度のATPが慢性的に存在し、細胞外ATP分解酵素によって分解されアデノシンを生成し、がんに対する免疫攻撃の強力な抑制物質として働いている。VRACはこのATPの放出経路を構成していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画時に予定していた高解像度のイメージングはまだ行なってはいないが、マクロ顕微鏡を用いた低倍のATPイメージングシステムの構築と、それを用いたラット肺組織からの肺胞膨張によるATP放出のイメージングに成功し、生理的な刺激による生体組織からのATP放出を初めて観測することができた。また細胞レベルでは低張刺激によってがん細胞において正常細胞とは異なったATP放出機序の違いを見出し、がん微小環境での高ATPレベル維持に関わっていることが示唆され、その機序と役割を明らかにする研究を進めている。これらはATP放出の機序と役割その多様性を探る上で重要であり、研究は全体としておおむね順調に進んでいるということができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
低張刺激によるがん細胞特異的なATP放出機序は容量調節性Cl-チャネル(VRAC)の阻害剤であるDCPIBで阻害され、炎症性物質Sphingosine-1-Phosphateで細胞容積変化を伴わずに活性化されることなどからVRACの関与が示唆される。VRACの分子実体は最近Leucine-rich repeat-containing protein 8A (LRRC8A)とそのisoformsであるLRRC8B-Eであることが明らかにされている。VRACががん細胞におけるATP放出に関与していることを明らかにするため、各種乳がん細胞でのLRRC8ファミリーの発現をリアルタイムPCRで調べる。またそれらのノックアウト実験を行う。また正常乳腺細胞の多様なATP放出機序をあらためて見直し、それらの発生要因や制御機構とがん細胞特異的放出機序との関連を調べる。そのため正常乳腺培養細胞に分化、増殖等状態を変える各種処理を行い、低張刺激等によるATP放出機序がどのように変換されるかを測定する。がん微小環境でATPは細胞外分解酵素によってアデノシンに加水分解され、そのアデノシンはがんに対する免疫攻撃を強力に抑制する働きをしていることが分かってきた。がん特異的なATP放出機序やその制御機序の解明は新たな治療のターゲットの開発にもつながる。
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| Causes of Carryover |
低倍のマクロ顕微鏡を用いた組織全体からのATP放出イメージング実験および樹立株乳がん細胞を用いた低張刺激によるATP放出実験の方が進展し、計画時に予定していた高解像度の蛍光観察の実験および初代乳腺培養を用いた実験が遅れている。そのためそれに関する光学部品や初代培養に必要な試薬等の購入がなかったため予定より少ない使用額となっている。
30年度はこれらの実験とがん細胞特異的ATP放出経路と思われるVRACの同定に必要な抗体や遺伝子実験を予定している。また正常乳腺細胞でのATP放出機序が多様であることを我々はすでに明らかにしているが、あらためてそれを見直してその経路実体を明らかにするとともにがん細胞の場合と比較することにより放出機序の多様性と役割を明らかにしていく。それらに必要な各種試薬の購入を行う。
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