2016 Fiscal Year Research-status Report
神経分化における伸長因子Elongin Aの標的遺伝子の探索とその制御機構の解明
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15K08177
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
安川 孝史 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 助教 (60291936)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | 転写伸長因子 / 神経分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Elongin AのES細胞神経分化における標的遺伝子の網羅的探索
抗Elongin A抗体を用いたChIPシークエンスの結果を解析したところ、神経分化に関わるホメオボックス遺伝子(Hox)等の一群の遺伝子ならびにMiat、RMSTなどのnon-coding RNA遺伝子上にレチノイン酸依存的なElongin Aの集積が認められた。さらに、複数の核内低分子RNA(snRNA)遺伝子、核小体低分子RNA(snoRNA)遺伝子、histone関連遺伝子上にもElongin Aが顕著に集積していることが判明し、Elongin Aがこれら遺伝子の発現や3’プロセッシングの制御にも関与している可能性が示唆された。
そこで、野生型とElongin Aホモ欠失型ES 細胞を用いてLIF非存在下で 4 日間浮遊培養した後、レチノイン酸存在下でさらに 4 日間浮遊培養して形成させた胚様体 (培養開始後 0, 4, 6, 8 日目に回収)よりRNAを調製し、RLM-RACE (RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends)、qRT-PCRによりsnRNA、snoRNA遺伝子ならびにhistone関連遺伝子の転写状態(発現、転写産物のプロセッシング等)について解析を行ったが、有意な差は認められなかった。
さらにElongin Aの局在が認められた遺伝子上にRNAポリメラーゼ II (Pol II)が共局在していることを確認するために抗Pol II抗体(N20)を用いてChIPシークエンスを行ったが、バックグラウンドが高く解析が困難であったため、現在、抗体を変えてChIPシークエンスを実施中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
抗Elongin A抗体を用いたChIPシークエンスを実施し、レチノイン酸刺激によって、Elongin AがHox遺伝子群や神経分化に関わるnon-coding RNA遺伝子上に、顕著に集積することが判明し、以前行ったRNAシークエンスのデータと一致することが確認出来た。
Elongin Aが複数のsnRNA遺伝子、snoRNAならびにhistone関連遺伝子の発現や3’プロセッシングの制御にも関与している可能性が示唆されたため、その確認に注力しマウス胎仔を用いたChIPシークエンスには着手できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)新たな抗Pol II抗体(D8L4Y)を用いたChIPシークエンス解析を進める。その際、サンプル間の定量性を持たせるためにヒト培養細胞(HeLa)のクロマチンをスパイク・インとして加えて行う。
(2)レチノイン酸添加によりElongin A/Pol II間の結合が認められたものをElongin Aの標的遺伝子として同定し、個別のChIP等による検証を行う。
(3)マウスの神経発生におけるElongin Aの標的遺伝子の網羅的探索のためにマウス胎仔を用いたChIPシークエンスの条件検討を試みる。
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